الطرق العامة لفصل الاحماض النووية

بايولوجي جزيئي عملي
الطرق العامة لفصل الاحماض النووية
عملية دراسة وتحليل الحوامض النووية تتطلب وجود نموذج نقي للحامض النووي لذلك تعد عملية استخلاص وتنقية الحوامض النووية احدى الركائز الاساسية في دراسة الحوامض النووية وتختلف طرق الاستخلاص باختلاف المصادر التي يراد استخلاص الحوامض النووية منها لكنها لابد ان تتضمن الخطوات التالية:
1. الحصول على مصدر للخلايا التي يراد استخلاص الحوامض النووية منها (تنمية البكتريا او الحصول على مسحة خلوية او نسيج مزروع)
2. ازالة وتحطيم الجدران والاغشية الخلوية (تختلف باختلاف نوع الخلايا ومصدرها مثل استخدام الانزيمات ، استخدام الموجات فق الصوتية، استخدام النتروجين السائل ، التحطيم بالكرات الزجاجية ، استخدام المنظفاتSDS )
3. تحطيم الاغشية النووية في حالة كون الخلايا حاوية على انوية
4. التخلص من المكونات الخلوية والبروتينات (بضمنها الانزيمات المححلة للحوامض النووية)
وبصورة عامة فان الطرق الاساسية لفصل الاحماض النووية هي ثلاث طرق اساسية منها تطورت جمع الطرق المستخدة حاليا لفصل الاحماض النووية وهي:
اولا:طريقة الفينول كلوروفورم: ايزواميل الكحول
تعتمد هذه الطريقة على قدرة هذه المواد على مسخ البروتينات الموجودة في نموذج الخلايا المحطمة وعزلها عن الحوامض النووية وتثبيط الانزيمات المحللة للحوامض النووية وبالتالي الحفاظ على الاحماض النووية .
تبدا عملية الاستخلاص بتكسير الخلايا المراد استخلاص الحامض النووي منها في محلول دارئ ذي اس هيدروجيني 8 حاوي على مادتي EDTA و Tris-cl ثم اضافة كمية مساوية لمحلول الخلايا المحطمة من الفينول كلوروفورم ايزواميل الكحول ومزجه لعدة مرات ومن ثم الترسيب للبروتينات الممسوخة بالنبذ المركزي بسرعة 6000 دورة/دقيقة لخمس دقائق وتكرار هذه العملية مرة ثانية بمزيج الكلوروفورم ايزواميل الكحول وثالثة بالكلوروفورم لوحده لغرض التخلص من جميع البروتينات الموجودة في العينة.
وثم يتم تركيز الحامض النووي بترسيبه بالكحول المطلق المبرد او الايزوبروبانول وثم غسله الايثانول 70% وتجفيفة واذابته بحجم قليل من دارئ TE وحفظه بالتجميد لحين الاستخدام




ثانيا: طريقة الاستخلاص بالطرد المركزي الفائق مع كلوريد السيزيوم او السكروز
تعتمد هذه الطريقة على مزج الخلايا بعد تحطيمها مع محلول عالي التركيز لملح كلوريد السيزيوم او السكروز (5.6 مولاري بالنسبة لكلوريد السيزيوم) وتعريضها لنبذ مركزي فائق (بسرعة 48000 دورة/دقيقة) لمدة 48 ساعة بعد اضافة مادة الاثيديوم برومايد. اذ تؤدي هذه العملية تكوين مدرج كثافة عن طريق انتشار جزيئات كلوريد السيزيوم على طول انبوبة الطرد المركزي واصطفاف المكونات الخلوية بالمناطق ذات الكثافة المساوية لها فتترسب الاحماض النووية (الDNA و RNA ) في المناطق ذات الكثافة المساوية لها والبالغة 1.7 غم / سم3 للدنا و1.65 للرناويتم تعريض انابيب الطرد المركزي بعد انتهائه الى مصدر اشعة فوق بنفسجية فتظهر هذه الاحماض النووية بشكل حلقات حمراء اللون يتم ثقب الانبوبة وسحب الحامض النووي المراد استخلاصه وبعدها يتم التخلص من الاثيديوم برومايد بالنفاذية ومن ثم ترسيب الحامض النووي بالكحول المطلق المبرد اوالايزوبروبانول ومن ثم اذابته بدارئTE وحفظه بالتجميد لحين الاستخدام.
تستخدم هذه الطريقة لفصل البلازميدات المغلقة والمفتوحة حيث ان الاثيديوم برومايد يرتبط بكفاءة عالية مع البلازميدات المفتوحة مقارنة مع البلازميدات المغلقة فيؤدي ذلك الى الاختلاف في كثافتهما فتصبح المفتوحة اكثر كثافة من البلازميدات المغلقة وتنفصل طبقة البلازميدات المغلقة كطبقة علوية تليها طبقة البلازميدات المفتوحة الاكثر كثافة. كما تستخدم هذه الطريقة في تنقية جميع نماذج الاحماض النووية المستلصة بالطرق الاخرى كما يمكن استخدامها في فصل الاحماض النووية للعاثيات والرواشح وغيرها.
ثالثا: طريقة استخدام القواعد الكيمياوية والطرد المركزي
تستخدم هذه الطريقة لفصل جزيئات الحوامض النووية صغيرة الحجم مثل دنا البلازميدات والعاثيات والرواشح عن الجزيئات الكبيرة من الحوامض النووية ، تعتمد هذه الطريقة على استخدام اس هايدروجيني عالي يتراوح بين 11 الى 12 ويتم توفيره باستخدام هيدروكسيد الصوديوم فيؤدي انفصال الاشرطة المزدوجة للاحماض النووية الى مفردة وعند اضافة مادة حامضية وخفض الاس الهيدروجيني لمحلول الاستخلاص باضافة خلات الصوديوم الحامضية فان اشرطة الدنا سوف تزدوج مرة ثانية وتؤدي سرعة اعادة الارتباط الى تكوين شبكة معقدة ناتجة عن تشابك الجزيئات الكبيرة مع بعضها البعض تتداخل مع البروتين الممسوخ بفعل مادة SDS المستخدمة في تحطيم الخلايا ومن ثم ترسبهما سوية بفعل الطرد المركزي وبقاء الدنا الصغير الحجم (دنا البلازميدات او العاثيات اوالرواشح ) في الرائق ومن ثم يتم تركيزها في المحلول بالترسييب بالكحول المبرد واذابتها في حجم صغير من دارئ TE او الماء المقطر المعقم المزالة ايوناته.


تنمية الخلايا البكترية لاستخلاص الحامض النووي :
1. تنشر البكتريا المراد استخلاص الاحماض النووية منها على وسط صلب ملائم وتحضن بدرجة37 م لمدة24 ساعة، بعدها تؤخذ مستعمرة منفردة وتستعمل لتلقيح50 مل من وسط لوريا السائل Luria broth وتحضن بدرجة 37 م لمدة 24 ساعة .
.2ينقل المزروع السائل إلى أنبوبة بولي اثيلين معقمة و ينبذ بسرعة4000 دورة / دقيقة لمدة 10 دقائق.
.3يزال الرائق ويعلق الراسب في5 مل من دارئTE ثم تنبذ الأنابيب بسرعة 4000 دورة / دقيقة .
.4 تكرر الخطوة السابقة (عملية الغسلWashing ) لمرتين بعدها يعلق الراسب في5 مل من الدارئ وتحفظ الانابيب بدرجة 4 م لحين الاستعمال .