RT- PCR

تفاعل البلمرة المتسلسل(الوقت الحقيقي)
Real-Time PCR
تفاعل البلمرة المتسلسل(الوقت الحقيقي)
هو تفاعل تضاعف وتزايد في اعداد نسخ قطع DNA الهدف مع وجود كاميرا او كاشف(الصبغات المشعة) يدون ويرصد هذه العمليات لأجل اعطاء تقرير مفصل عن عدد الدورات ومايقابلها من تزايد وتضخم لنسخ الجين الهدف.
هناك العديد من الطرق التي نستطيع من خلالها متابعة ورصد تضاعف الـDNA في العينة اذ تستعمل المعلمات المشعة (fluorescent marker) للارتباط مع DNA المتضاعف وكلما زادت اشرطة DNA المنسوخة زاد استعمال الصبغة المشعة .لذلك تعتبر استعمال هذه التقنية مفيد جدا بسبب القدرة على مشاهدة عمليات التضاعف والاستغناء عن عملية ترحيل ال DNA في الاكاروز.

اهم الطرق التي تساعدنا في رصد تضخم الـ DNA :-
1- الصبغات المضيئة (Fluorescent dyes) :-
ان استعمال الصبغة المشعة في تقنية RT-PCR يعتبر الارخص والابسط لرصد التضاعف حيث ان ارتباط هذه الصبغة يتزايد مع تزايد اشرطة DNA المزدوجة المنسوخة حديثا ,لكن الغير مفيد في هذه الطريقة هو ان الصبغة ترتبط مع اي تضاعف لاشرطة DNA بدون تخصص (specificity.) للجين المطلوب.

2- البروب المشع (Fluorescent probes) :-
البروب المشع هو قطعة من الDNA متممة للجين المطلوب تضخيمه وتكاثره حيث تكون معلمة بالصبغة المشعة.
يعد التاكمان(Taqman) البروب الابسط والاكثر شيوعا حيث يتكون من قطعه من الDNA تحتوي على جزيئة (Reported) مشع في احد الاطراف وجزيئة (quencher) ماصة للاشعاع في طرفها الاخر (تمتص الاشعة المنبعثة من الجزيئة الباعثة للاشعاع (Reported) لذلك فان الاشعاع المنبعث من البروب يكون واطئ او ضعيف في الظروف الطبيعية, عندما يبدئ الجهاز بالعمل وتبدأ اشرطة الDNA بالتضاعف يبدأ البروب بالارتباط مع الجين المطلوب لكن سرعان ما ينشطر وينفلق بفعل انزيم البوليميريز(Polymerase) لذلك فان ال(Reported) وال(quencher) سوف ينفصلان فيزيائيا ثم سيتزايد انبعاث الاشعاع بسبب ابتعاد quencherعن Reported حيث يبدأ الاخير بالاشعاع بصورة طبيعية.