PCR

تفاعل البلمرة المتسلسل
( Polymerase Chain Reaction PCR)

تفاعل البلمرة المتسلسل -:(PCR) هو عبارة عن تضخيم جزيئة واحدة أو بضع نسخ من قطعة من الحمض النووي عبر عدة أوامر، لتوليد آلاف الملايين من النسخ من تسلسل الحمض النووي بصفة خاصة ,وهي تقنية لايمكن الغنى عنها في كثير من الأحيان تستخدم في مختبرات البحوث الطبية والبيولوجية لمجموعة متنوعة من التطبيقات.
وتشمل هذه الطريقة استنساخ DNA وتكثيره لغرض التحليل الوظيفي للجينات ، وتشخيص الأمراض الوراثية ، وتحديد البصمات الوراثية (المستخدمة في علوم الطب الشرعي واختبار الأبوة) ، وكشف وتشخيص الأمراض المعدية. في عام 1993 ، منحت موليس جائزة نوبل في الكيمياء لمايكل سميث لعمله على PCR حيث ان أسلوب عمله يعتمد على الدرجات الحرارية ، ويتألف من دورات التسخين والتبريد المتكررة للتفاعل مع الحمض النووي.
ان الهدف من استخدام تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل Polymerase Chain Reaction (PCR) هو لتضخيم عدد نسخ الجين للوصول الى عدد معين من النسخ لاستعماله كقالب لتكثير وتضاعف DNA.
يمكن اجمال عمل الفحص كالاتي :-
تفاعل الدورات The cycling rection
هناك ثلاث مراحل رئيسية في تفاعل (PCR) والتي تتكرر حوالي 30 الى 40 مرة وهذه المراحل تحدث في جهاز الدورات الاوتوماتيكي والذي يستطيع ان يهيئ ظروف حرارة وتبريد على التوالي للانابيب الخاصة بالجهاز لبدء التفاعلات الخاصة بنسخ الجين المطلوب في وقت قصير.
1-مسخ الجين Denaturation عند درجةC ?94
بعد بدء عملية النسخ تبدا الجديلة المزدوجة للDNA بالتباعد والانفتاح لينتج خيطان مفردان من نفس الجين الاصلي .
2- مرحلة الالتئامAnnealing عند درجة C? 54
يبدا البرايمر Primers بالاهتزاز والاقتراب من القالب Template حيث يكون هذا الاهتزاز على شكل حركة بروانية Brownian motion حيث تبدا اصرة ايونية بالتكوين بين الشريط المفرد من البرايمر والقالب ,وهنا يعمل انزيم البوليميريز على بدء النسخ للقالب لتكوين نسخ جديدة كثيرة, ان الاصرة الايونية بين البرايمر والقالب تكون قوية جدا بحيث يصعب تفككها في درجات الحرارة الاعتيادية .
3-التمدد Extension عند درجة C ? 72
تعتبر هذ الدرجة هي الدرجة المثالية لعمل انزيم البوليميريز حيث تبدا هنا القواعد النتروجينية بالاضافة بواسطة البوليميريز (اضافة المتمم للقالبComplementary to the template) وبهذه الطريقة تبدا اشرطة الDNA بالتضاعف والتزايد الاسي حيث تتضاعف من شريط واحد (القالب Template)الى شريطين ثم اربعة ثم ثمانية اشرطة وهكذا.
تضاف المواد الكيمياوية التالية الى العينة وحسب الكميات المذكورة في الجدول:-

المادة الكيمياوية الحجم
Master mix lµ 12.5
DNA lµ 4
Forward primer lµ 1.5
Revers primer lµ 1.5
Deionizer D.W. lµ 5.5
Total lµ 25

يضبط مراحل وعدد دورات جهاز Thermo cycler حسب الجدول الاتي :
Extension Annealing Stage 2 Stage 1
? 70 ? 70 ? 54 ? 95 ? 95
7 min 1 min 1 min 30 sec 5 min
35 cycle