مختبر الاحياء المجهرية في الحليب

عزل الاحياء المجهرية من الحليب

يعد الحليب بيئة غذائية ملائمة لنمو الاحياء المجهرية عند توفر درجات الحرارة الملائمة, فهو غني بالبروتينات والكاربوهيدرات والدهون والمعادن والفيتامينات المهمة بالاضافة الى دالة الحموضة الملائمة (6.7) ورطوبته الملائمة للنشاط المايكروبي.لذلك فهو عرضة للتلف بالبكتيريا والاعفان والخمائر و بصورة سريعة .ومن جهة اخرى قد يصبح الحليب وسطا ناقلا لكثير من الامراض للانسان مثل Q-fever و Malta fever و التسمم الغذائي بالسموم المعوية لبكتيريا Streptococcus pyogens في حال لم يبستر بالصورة الصحيحة.
من الاجناس الشائعة في الحليب: Micrococcus , Coli forms, Lactobacillus Streptococcus.كما توجد انواع ممرضة مختلفة باختلاف مصدر التلوث وتشمل:
1- الحيوان :Mycobacterium bovis, Staph. aureus, Brucella.
2- الانسان: Salmonella , Shegella.
3- البيئة: Clostridium , Bacillus.


ميكانيكية تلف الحليب بالاحياء المجهرية

يحوي الحليب الخام عددا قليلا من البكتيريا الشائعة التواجد والمذكورة اعلاه , وعادة لا تنمو هذه البكتيريا بصورة ملحوظة اذا تم معالجة الحليب بصورة صحيحة زاما عند ترك الحليب الخام لعدة ساعات في حقل الانتاج فسرعان ما تبدأ فيه التغيرات التالية:
1- تبدأ الاعداد البكتيرية بالانخفاض لفترة قصيرة تسمى (Bactericidal phase) بسبب إحتواء الحليب على مواد مضادة للبكتيريا مثل : Lysozyme , Lactenin Leucocytes, Lactoferrines. ويعد Lactenin اشد هذه المواد تأثيرا على البكتيريا إذ يتكون من ثلاث مواد تعمل سوية ضد البكتيريا هي: Lactoperoxidase, Thiocyanatase, Hydrogen peroxidase .
2- بعد انتهاء المرحلة الاولى تنشط مسبحيات الحليب Streptococcus lactis في درجات الحرارة الدافئة كون هذه البكتيريا تمتاز بسرعة استهلاكها لسكر الحليب (اللاكتوز) وتكوين حامض اللاكتيك فتصل نسبة الحموضة الى (1%) وينخفض ال pH الى (4.6) وهذا يسبب توقف نمو مسبحيات الحليب.
3- المرحلة الثالثة هي نشاط عصيات الحليب Lactobacillus الاكثر مقاومة للحموضة اذ ترفع نسبة الحموضة الى (2%) وبذلك يتوقف نمو بقية فلورا الحليب.
4- عند انتهاء مرحلة تحول سكر اللاكتوز الى حامض اللاكتيك تبدأ مرحلة اكسدة الحامض من قبل الاعفان والخمائر حيث يتحول الى ماء وCO2 لاسيما عفن Geotrichum وتبعا لذلك تنخفض الحموضة.
5- تنشط البكتيريا المعفنة مثل Bacillus و Proteus, Pseudomonas و Achromobacter والعديد من الاعفان حيث التي تحلل ما تبقى من بروتين ودهون فيتحول الحليب الى سائل عفن متزنخ.

A) تلف الحليب الخام
يحوي الحليب الذي حلب للتو ما بين ( 103-102) بكتيريا /مل وان العد البكتيري اللازم لاحداث تغيرات غير مرغوبة من لون وطعم يتطلب ( 107) خلية /مل. من اهم المشاكل المايكروبايولوجية التي تحدث في الحليب الخام:

طبيعة التغيرات الكائن المسبب
تجبن حلو (بسبب افراز انزيم Renin وترسب ال Casain وليس بسبب الحموضة) Bacillus cereus
تجبن غازي (تكوين كمية كبيرة من الغازات) Clostridium& Coliforms
لزوجة في الحليب (بسبب انتاج الكبسولة) Alcaligenes
طعم غير مرغوب فيه نتيجة تحلل الحوامض الشحمية Ps. fluorescence
تلون الحليب بلون احمر Serretia marcescns



B) تلف الحليب المبستر

عملية البسترة هي تعريض الحليب لدرجة حرارة (72 م5) لمدة (15 ثانية) او درجة (63 م5) لمدة (30 دقيقة) وذلك للسيطرة على البكتيريا الممرضة ( مثل السل والسالمونيلا والبروسيلا و اللستيريا) واطالة فترة الخزن.
يحدث تلف الحليب المبستر بسبب مقاومة عدد من البكتيريا الخضرية المحبة للحرارة (Themophilic bacteria) مثل Lactobacillus thermophilus او البكتيريا المقاومة لحرارة البسترة (Thermoduric) مثل Bacillus subtilis , Microbacterium, Micrococcus.

C) الحليب المجفف

يصنع هذا النوع بازالة جزء من الماء من الحليب ثم يعقبه عملية مجانسة ويعامل بالحرارة قبل او بعد التعليب لمنع فساده.عند الفحص المايكروبي للحليب المجفف يلاحظ كون البكتيريا الناتجة متشابهه أي ان المزروع نقي (Pure culture) وهذا يدل على ان التلوث ناتج عن وجود سبورات البكتيريا المقاومة للمعاملة الحرارية , اما اذا كان المزروع عبارة عن مزيج من الاحياء المجهرية فذلك يدل على عدم كفاءة المعاملة الحرارية او حدوث تلوث اثناء الاستخدام او اثناء الفحص.

D) الحليب المعقم
يعقم الحليب باستخدام درجة حرارة عالية (121 م5) لمدة (15-20 دقيقة) ويعبأ بقناني زجاجية او معدنية وبهذه الطريقة يتم القضاء على كافة المايكروبات التي تسبب فساده اثناء خزنه تحت الظروف الاعتيادية. وقد تتواجد اعداد قليلة من البكتيريا المقاومة لحرارة التعقيم والمكونة للسبورات مثل Bacillus spp. , Clostridium spp..






طريقة العمل:

1- Direct microscopic count (Breed method)
أ. تمزج العينة جيدا لنشر البكتيريا بشل متساوي في الوسط وغك تكتلات الاحياء المجهرية وينقل (0.01مل) من الحليب ويفرش على مساحة مربع طول ضلعه (1سم) , يجفف ببطئ حتى لاتتكون شقوق في الغشاء .
ب. يوضع السلايد على بيكر يغلي لمدة (5 دقائق) لتثبيت غشاء الحليب بالبخار .
ج. يغمر السلايد بالزايلول لمدة دقيقة واحدة لازالة الحبيبات الدهنية ثم بالكحول لازالة الزايلول ثم يغطس السلايد في بيكر حاوي على الماء المقطر المعقم وليس ماء جاري حتى لايزال الغشاء.
د. يصبغ بصبغة methylene blue لمدة (15 ثانية) ثم يغطس بالماء لازالة الصبغة ثم تجفف بالهواء .
ه. تفحص عدة حقول ويستخدم القانون التالي لحساب عدد البكتيريا:


x


2- Standard plate count
أ. اعمل سلسلة تخافيف لعينة الحليب وخذ 1 مل او 0.1 مل من التخفيف المناسب الى اطباق معقمة ثم يضاف وسط Manitol salt agar ,MacConkey agar, ,Nutrient agar وبمقدار طبقين لكل تخفيف.
ب. تحضن الاطباق في 37 م لمدة 24-48 سلعة.
ج. تعد الاطباق التي اعدادها بين 30-300 مستعمرة /طبق.
د. يحسب عدد البكتيريا كالاتي:
Number of CFU = Number of colonies x (1/dilution factor) x Volume

3- اختزال الصبغة Dye reduction test
يستخدم هذا الاختبار لمعرفة الفعالية الحيوية للبكتيريا في الحليب اذ يتناسب النشاط طرديا مع العدد وحسب معدل تنفسها تتهيأ الضروف اللا هوائية فتختزل الصبغات. يستخدم لهذا الغرض نوعان من الصبغات هما Methylene blue , Resozurine.

أ‌. ينقل (10 مل) من الحليب الى انبوبة اختبار معقمة ذات سداد لولبي ويضاف لها (1مل )من صبغة Methylene blue وتمزج جيدا بقلب الانبوبة بهدوء ويجب التأكد من عدم وجود فقاعات غازية حتى لا تتأكسد الصبغة.
ب‌. تحضن الانبوبة في حمام مائي وتفحص كل نصف ساعة لمدة 6 ساعات .وكلما زادت سرعة الاختزال فان ذلك يعني احتواء الحليب على اعداد اكبر من البكتيريا
ت‌. تقيم جودة الحايب كالاتيك
1. ممتاز:اذا لم تختزل الصبغة خلال فترة تزيد عن ثمان ساعات .
2. جيد: اذا اختزلت الصبغة خلال فترة 6-8 ساعات.
3. وسط: اذا اختزلت الصبغة خلال فترة 2-6 ساعات.
4. رديء: اذا اختزلت الصبغة خلال فترة اقل من س