البكتريا المعويه Enterobacteraiceae

المختبر الثالث عشر والرابع عشر
البكتريا المعويه Enterobacteraiceae
المقدمة
تضم عائلة المعويات اجناس متعددة يصعب التمييز بينها تحت المجهر .عصيات سالبة بصبغة غرام ، متحركة او غير متحركة ، لاتكون سبورات تبلغ حجومها من 3-5 مايكرون طولا 0.5 – 0.7 مايكرون عرضها ، جميعها مخمرة لسكر الكلوكوز ، سالبة لاختبار الاوكسيديز مع بعض الشواذ موجبة لاختبار الكاتاليز ، وتختزل النترات NO3 الى نتريت NO2. الموطن الطبيعي لها الامعاء الدقيقة للانسان والحيوان حتى ان قسما منها مثل E. coli تشكل البكتريا الطبيعية للامعاء في حين ان انواعاً اخرى مثل ال Salmonella وال Shigella تعتبر مرضية خطرة للانسان .
اهم الاجناس التي تضمها
Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Salmonella, Proteus, Shigella, Yersinia, Providencia, Hafnia, Morganella, Pseudomonas, Acinetobacter, Alcaligenes
العينات
تؤخذ العينات في الحالات المرضية من الادرار ، الخروج ، او في المياه في حالات الانواع الحرة المعيشة .

اهم الفحوصات التفريقيه

فحص تحلل التربتوفان Tryptophan Hydrolysis (Indole)
بعض الانواع البكتيريه مثل E. coli تملك القابليه على شطر الحامض الاميني التربتوفان الى مكونين هما الاندول Indole و الحامض البايروفي Pyruvic acid والانزيم المسؤول عن عمليه التحلل هذه هو التربتوفاينيز Tryptophanase. يمكن تشخيص الاندول بسهوله بواسطة كاشف كوفاكس Kovacs’ reagent . هذا الفحص مفيد جدا في تشخيص بكتريا E. coli عن الانواع البكتيريه المعويه القريبه منها. يستخدم ماء الببتون Peptone Water او Tryptone broth (1%) في هذا الفحص لاحتوائهما على كميه كبيره من Tryptophan. الببتون يشتق من كازائين مهضوم بواسطة عصارة البنكرياس.
المواد
• Kovacs’ reagent
• Tryptone broth or Peptone water
• E. coli culture


بعد تلقيح الوسط بالبكتريا يحضن لمدة 24 ساعه بدرجة 37م ، لغرض فحص الاندول يضاف للبروث الملقح 10-12 قطره من كاشف كوفاكس Kovacs’ reagent. تكوين حلقه حمراء على الطبقه العليا من الانبوبه دليل على الفحص الايجابي للاندول.

تخمر السكريات المختلطه Mixed Acid (Methyl-Red) Fermentation
العديد من البكتريا المعويه (سالبة الكرام خصوصا)، يمكن تفريقها عن بعضها بواسطة الناتج النهائي لعملية الايض الخاصه بها عندما تستهلك الكلوكوز (تخمره) على وسط Methyl Red and Voges-Proskauer (MR-VP). بعض الانواع البكتيريه مثل Escherichia, Salmonella, Proteus و Aeromonas تخمر الكلوكوز لتنتج كميات كبيره من حامض اللاكتك Lactic Acid ، حامض السكسنيت Succinic Acid و حامض الفورميك Formic Acid بالاضافه الى CO2 ، H2 و الايثانول Ethanol. تجمع هذه النواتج تؤدي الى خفض الـ pH للوسط الى مادون الـ(5). اذا ما اضيف المثيل الاحمر الى هكذا وسط (ذو حامضيه مرتفعه) سيتكون لون احمر (لون الدليل المثيلي)، فنستنتج بان الكائن المجهري النامي في الوسط هو مخمر لحوامض مختلطه (Mixed Acid Fermenter). تعتبر الاحياء المجهريه المخمره للحواض المختلطه عموما منتجه للغاز وذلك بسبب انتاجها لانزيم formic Hydrogenylase والذي يقوم بشطر حامض الفورميك الى جزئين متساويين من CO2 ، H2.
المواد
• MR-VP broth
• E. coli and Klebsiella culture
• Methyl-Red Indicator
يضاف 3-4 قطرات من Methyl-Red Indicator الى الانابيب الحاويه على وسط MR-VP broth والملقحه ببكتريا E. coli و Klebsiella ، ظهور اللون الاحمر التوتي Cherry Red مباشرة بعد اضافة الكاشف دلاله على الفحص الموجب لاحمر المثيل.

فحص تخمر البيوتانيدويل Butanediol Fermentation (Voges-Proskauer)
الفحص السلبي لاحمر المثيل يمكن ان يعد دلاله على ان الكائن المجهري المنمى في وسط MR-VP broth منتج لكميات كبيره من 2,3, بيوتانيدويل (2,3, Butanediol) والايثانول بدلا عن انتاج الاحماض. جميع انواع Enterobacter و Serratia بالاضافه الى اجناس من Erwinia و Bacillus و Aeromonas تقوم بذلك.
انتاج هذه المنتجات النهائيه الغير حامضيه تؤدي الى تقليل في حموضية وسط MR-VP broth (قله في انخفاض الـ pH) مؤديه الى النتيجه السلبيه بلنسبه لفحص احمر المثيل (MR). لسء الحظ ليس هناك اختبار للكشف عن (2,3, Butanediol)، مع ذلك فان( Acetoin (acetylmethylcarbinol احد المركبات الاوليه للـ (2,3, Butanediol) يمكن ببساطه تحديده والكشف عنه بواسطة كاشف بارييت Barritt’s reagent (مكون من alpha Naphthol و KOH)، عند تلقيح وسط MR-VP broth بالبكتريا ولمدة ثلاثة ايام نقوم باضافة الكاشف ، سيتحول لون الوسط الى اللون الوردي البيرغندي (Pink-Burgundy) دلاله على الفحص الموجب للـ VP .

المواد
• MR-VP broth
• E. coli and Enterobacter aerogenes or Klebsiella culture
• Barritt’s reagent (Voges-Proskauer) Indicator
يضاف (0.5 مل) 18 قطره من محلول الكشف الاول (alpha naphthol) الى الوسط الملقح الحاوي على 1 مل من الزرع ، ثم يضاف كميه مساويه للكاشف الاول من الكاشف الثاني (KOH) الى نفس الانبوبه، ترج الانبوبه بقوه ((يعتبر مهم جدا وذلك لغرض التهويه)) كل 20 ثانيه حتى تحول لون الوسط الى الاحمر الغامق او الوردي


فحص استهلاك السترات Citrate Utilization
قابلية بعض الاحياء المجهريه مثل Enterobacter aerogenes و Salmonella typhimurium على استهلاك السترات كمصدر وحيد ورئيسي للكاربون يمكن ان يعتبر مفيد جدا في عملية التفريق بين البكتريا المتواجده في امعاء الانسان.
وسط السترات بنوعيه (Koser’s citrate medium and Simmons citrate agar) يمكن ان يستخدم في عملية الكشف عن قابلية البكتريا في استهلاك السترات. في كلا الوسطين ، مادة الـ Sodium Citrate تعتبر المصدر الرئيسي للكاربون والنيتروجين يجهز بواسطة املاح الامونيوم Ammonium salts بدلا من الاحماض الامينيه . يحوي الوسط على Bromthymol blue والذي له دور مهم في تحويل لون الوسط الى الازرق عند ارتفاع قيمة الـ pH. عند تلقيح الوسط بالبكتريا وحضنها لمدة 24 ساعه بدرجة 37م، في النتيجة الايجابيه (Enterobacter aerogenes) نلاحظ لون ازرق بروسي (ازرق داكن) Prussian blue color.

فحص تحلل اليوريا Urea Hydrolysis
يعتبر انتاج انزيم اليوريز Urease من الخصائص المهمه في تفريق البكتريا المعويه. يقوم الانزيم بشطر جزيئة اليوريا الى الامونيا، تعتبر Proteus vulgaris, Providencia, and Morganella من الاجناس المنتجه لانزيم اليوريز. وسط اليوريا يعتبر من الوساط البفريه Buffered solution المنتجه من خلاصات الخمائر بالاضافه الى اليوريا. كما يحوي على الـ Phenol red كمحدد للـ pH. بما ان اليوريا غير مستقره وتتحطم في الاوتوكليف عند التعقيم لذا تعقم بواسطة الترشيح ثم تضاف الى الوسط المعقم. عند افراز اليوريز في الوسط الملقح من قبل البكتريا فان المونيا المنشطره من اليوريا بواسطة الانزيم سوف ترفع قيمة الـ pH. وبسبب القيمه العاليه للـ pH فان Phenol red يتغير من الاصفر الى الاحمر الكرزي Cerise Red color.

فحص السكر الثلاثي الحديدي Triple Sugar Iron (TSI)
او
فحص كلكلر الحديدي Kligler s Iron agar (KIA)
يعتبر (TSI) و (KIA) من الفحوصات المستخدمه للكشف عن التخمر الكاربوهيدراتي وانتاج الـ H2S في البكتريا المعويه. هذه الاوساط تمتلك العديد من المواد الاوليه التي تستطيع البكتريا المعويه استهلاكها متضمنة عدة انواع من الكاربوهيدرات والبروتينات اضافة الى الثايوسلفات. اعتمادا على نوع المواد المستخدمه في عملية التخمر يمكن تفريق البكتريا المعويه. كلا الوسطين يحويان على خلاصة لحم البقر والخمائر Beef Extract و Yeast Extract والببتون.
السكريات القابله للتخمر في وسط TSI هي ((الكلوكوز Glucose ، اللاكتوز Lactose و السكروز Sucrose)). السكريات القابله للتخمر في وسط KIA هي ((الكلوكوز Glucose و اللاكتوز Lactose)). يعتبر Sodium Thiosulfate المصدر الوحيد للسلفات لغرض انتاج H2S. كلا الوسطين يحيان على Ferrous Sulfate والتي تتفاعل مع H2S لتكون الترسب الاسود في قعر الانبوبه . الكاشف الموجدود في كلا الوسطين للـ pH هو Phenol Red. يعطي Phenol Red لون احمر عند pH 7.4 و لون اصفر في الوسط الحامضي ولون احمر قاتم في الوسط القاعدي. تلقح الاوساط بواسطة الطعن الى اسفل الانبوبه ثم التخطيط على السطح.

Interpretation of Enterobacteraiceae reactions on Kligler’s iron agar (KIA)
Interpretation Reaction
Only glucose fermented Acid butt (yellow) and alkaline slant (red)
Glucose and lactose fermented Acid throughout medium (butt and slant yellow)
Neither glucose nor lactose fermented Alkaline throughout medium (butt and slant red)
Gas-producing bacteria Gas bubbles in butt or cracks in the medium
Hydrogen sulfide (H2S) produced Blackening in the butt




Typical reaction patterns of Enterobacteraiceae
on Kligler’s iron agar (KIA)
Bacteria species Sugar(s) fermented Reaction
Escherichia coli - Klebsiella
Enterobacter - Citrobacter diversus
Serratia liquefaciens Glucose: acid and gas
Lactose: acid and gas
Gas Forming Butt acid
Slant acid
Gas in butt
No H2S
Salmonella - Proteus
Citrobacter freundii Glucose: acid and gas
Lactose: No fermented
Gas Forming Butt acid
Slant alkaline
Gas in butt
H2S production
Shigella - Yersinia
Serratia marcescens
Providencia stuartii - Providencia rettgeri Glucose: acid only
Lactose: No fermented
No Gas Forming Butt acid
Slant alkaline
No Gas
No H2S
Salmonella paratyphi A
Hafnia alvei
Serratia marcescens
Morganella morgani Glucose: acid and gas
Lactose: not fermented
Gas Forming Butt acid
Slant alkaline
Gas in butt
No H2S
Alcaligenes
Pseudomonas
Acinetobacter No sugars fermented Butt neutral/alkaline
Slant alkaline
No Gas
No H2S



Tube e Tube d Tube c Tube b Tube a
A A A K - Slant
A A A K - Butt
- + - - - Gas
- - + - - H2S


فحص حليب اللتموس Litmus Milk Reactions
يحوي حليب اللتموس على 10% من Skim Milk وكميات قليله من اللتموس (تعتبر كدليل على تغير الـ pH) عند تحضير الوسط يكون الـ pH 6.8 . تعتبر هذه الدرجه من الحموضه ممتازه وملائمه جدا لنمو العديد من الاحياء المجهريه ويمكن ان يعتبر مساعدا جدا في عملية التشخيص. بالاضافه الى الى ذلك : لمعرفة وجود او عدم وجود تخمر في الوسط يمكن من خلاله معرفة نشاط بعض الخصائص الانزيميه البروتينيه للبكتريا. العديد من البكتريا الاختياريه التي تملك خاصيه الاختزال القوي (Strong Reducing Powers) تتمكن من استهلاك اللتموس كبديل لاستقبال الالكترونات مؤديه لتغير لون الوسط. يحتاج التفاعل الى 4-5 ايام وبدرجه 37م لكي يكتمل مع مراقبته كل 24 ساعه.
التفاعلات
1. التفاعل الحامضي Acid Reaction : يصبح اللتموس وردي اللون وهو مثالي للتخمر البكتيري.
2. التفاعل القاعدي Alkaline Reaction : يتحول اللتموس الى الازرق او البنفسجي الفاتح.العديد من البكتريا ذات النشاط المحلل للبروتينات تسبب هذه الظاهره خلال الـ 24 ساعه الاولى.
3. تفاعل اللتموس Litmus Reduction : الوسط الزرعي يتحول الى اللون الابيض بسبب استهلاك الاوكسجين اثناء تكاثر البكتريا.
4. تكوين الخثاره Coagulation Curd formation : تصلب الوسط نتيجة تخثر البروتين ، امل انبوبة الاختبار بزاويه 45° لتشاهد فيما اذا كان هناك تخثر او لا.
5. الببتنه Peptonization : يصبح الوسط نصف شفاف وغالبا ما يعطي لون رمادي على السطح بسبب البكتريا ذات النشاط المحلل للبروتينات.
6. اللزوجه Ropiness : تكوين نمو كثيف لزج في قعر الانبوبه.







النمو على الاوساط الزرعيه Growth on Cultural Media

اولا/ وسط الماكونكي MacConkey agar
يعتبر من الاوساط التفريقيه حيث تظهر بكتريا Escherichia coli على شكل مستعمرات صغيرة وردية اما بكتريا Klebsiella مستعمرات بيضوية وردية ذات مركز غامق بعد فترة حضانة 24 ساعة بدرجة 37 م ويحوي هذا الوسط املاح الصفراء كمانع لنمو البكتريا الموجبة لصبغة غرام. اما بكتريا Serratia marcescens فتكون باهتة اللون رماديه ، اما ال Pseudomonas فتكون ذات نمو غير منتظم وشفافه.


ثانيا/ وسط الايوسين مثيلين الازرق Eosin Methylin Blue media (EMB)
يعتبر من الاوساط التفريقيه حيث تظهر بكتريا Escherichia coli على شكل مستعمرات صغيرة ذات لون ازرق مخضر لماع معني Green Metallic Shine. في حين ان Klebsiella aeruginosa تكون مستعمرات وردية مخاطية ونادرا ما تمتلك بريق معدني.

ثالثا/ وسط السالمونيلا - الشيكيلا Salmonella – Shigella agar (S-S agar)
يعتبر هذا الوسط من الاوساط المهمه لعزل بكتريا Salmonella و Shigella حيث تظهر مستعمرات السالمونيلا بلون رمادي وتكون نهايات النمو ذات لون داكن اسود بسبب ترسب الثايوسلفات H2S.

رابعا/ وسط الاكار المغذي Nutrient agar
يعتبر من الاوساط العامه التي تنمو عليها تقريبا جميع انواه البكتريا (الموجبه والسالبه لصبغة كرام ، الهوائيه واللاهوائيه حسب ظروف الحضن). تظهر الانواع البكتيريه على وسط الاكار المغذي باشطال والوان مختلفه، حيث تظهر مستعمرات Serratia marcescens بلون احمر مميز بينما يكون نمو بكتريا Pseudomonas مميزا بسبب تكوينها للصبغات Pyocyanin (والتي تكون خضراء مصفره). اما نمو بكتريا Klebsiella فيكون مميزا بلزوجته حيث تكون المستعمرات الناميه مخاطية التكوين.

رابعا/ وسط الاكار الملون Chromedia agar
يعتبر من الاوساط العامه التي تنمو عليها تقريبا جميع انواه البكتريا (الموجبه والسالبه لصبغة كرام ، الهوائيه واللاهوائيه حسب ظروف الحضن). تظهر الانواع البكتيريه على وسط الاكار المغذي باشطال والوان مختلفه،.