مختبرات الوراثة العملي

تقدير الاحماض النووية Nucleic acid quantitation
تعد تقدير الحامض النووي في العينة عملية مهمة لتحديد مقدار تركيز الـDNA و RNA في العينة ودرجة نقاوته حيث تعتمد على هذه العملية الكثير من الفحوصات والتفاعلات الخاصة
بالـ DNA مثل جهاز PCR واجهزة وراثية اخرى .
هناك العديد من الطرق المستعملة لقياس DNA في العينة منها:
1. جهاز المطياف الضوئي spectrophotometer
2. جهاز Nanodrop

جهاز Nanodrop
يعتبر قياس الحامض النووي (DNA او RNA) في هذا الجهاز عملية سهلة وسريعة اضافة الى انها تكشف لنا عن نسبة الخطأ المحتمل وجودها في العينة حيث ان القراءات القياسية للحامض النووي هي كالاتي:
DNA= 1.8 ~
RNA= 2.0 ~
اما القراءات التي تختلف عن هذه النسب فهي دلالة على وجود تلوث في العينة, اي ان العينة لازالت حاوية على البروتين او بعض المواد الاخرى .تتم القراءة عند طول موجيnm 260 -280 .

طريقة عمل الجهاز:
1- اختر الايقونة الخاصة بالجهاز(Nanodrope) الموجودة على سطح المكتب.
2- اختر Nucleic acid من القائمة .
3- اختر نوع الحامض النووي DNA ,
4- اختر الوحدة القياسية الخاصة بالحامض النووي وهي ng/µL.
5- اختر الطول الموجي الملائم للمحلول المراد فحصه,ان الطول الموجي 280-260 هو الملائم لقياس وتقدير الحامض النووي.
6- اختر الايكونه (add to the report) لاضافة جميع القياسات الخاصة بجميع عيناتك وحفظها لحين الرجوع اليها عند الحاجة.
7- صفر الجهاز بواسطة (Blank المحلول المذيب للحامض النووي).يجب ان يكون هذا المحلول مذيب جيد للحامض النووي اضافة الى ان الـBlank المستعمل لتصفير الجهاز يجب ان يكون بنفس درجة pH ونفس الدرجة الايونية للمحلول المستعمل للمذيب للحامض النووي (DNA).
8- ضع 1-2 lµ من محلول البلانك على عدسة الجهاز ثم انزل ذراع الجهاز.ثم اضغط على كلمة(blank )
9- نظف العدسة بورق التنظيف الخاص ثم ضع العينة واضغط على كلمة (Measure) ليبدء الجهاز بالقياس.




تفاعل البلمرة المتسلسل(الوقت الحقيقي)
Real-Time PCR
تفاعل البلمرة المتسلسل(الوقت الحقيقي)
هو تفاعل تضاعف وتزايد في اعداد نسخ قطع DNA الهدف مع وجود كاميرا او كاشف(الصبغات المشعة) يدون ويرصد هذه العمليات لأجل اعطاء تقرير مفصل عن عدد الدورات ومايقابلها من تزايد وتضخم لنسخ الجين الهدف.
هناك العديد من الطرق التي نستطيع من خلالها متابعة ورصد تضاعف الـDNA في العينة اذ تستعمل المعلمات المشعة (fluorescent marker) للارتباط مع DNA المتضاعف وكلما زادت اشرطة DNA المنسوخة زاد استعمال الصبغة المشعة .لذلك تعتبر استعمال هذه التقنية مفيد جدا بسبب القدرة على مشاهدة عمليات التضاعف والاستغناء عن عملية ترحيل ال DNA في الاكاروز.

اهم الطرق التي تساعدنا في رصد تضخم الـ DNA :-
1- الصبغات المضيئة (Fluorescent dyes) :-
ان استعمال الصبغة المشعة في تقنية RT-PCR يعتبر الارخص والابسط لرصد التضاعف حيث ان ارتباط هذه الصبغة يتزايد مع تزايد اشرطة DNA المزدوجة المنسوخة حديثا ,لكن الغير مفيد في هذه الطريقة هو ان الصبغة ترتبط مع اي تضاعف لاشرطة DNA بدون تخصص (specificity.) للجين المطلوب.

2- البروب المشع (Fluorescent probes) :-
البروب المشع هو قطعة من الDNA متممة للجين المطلوب تضخيمه وتكاثره حيث تكون معلمة بالصبغة المشعة.
يعد التاكمان(Taqman) البروب الابسط والاكثر شيوعا حيث يتكون من قطعه من الDNA تحتوي على جزيئة (Reported) مشع في احد الاطراف وجزيئة (quencher) ماصة للاشعاع في طرفها الاخر (تمتص الاشعة المنبعثة من الجزيئة الباعثة للاشعاع (Reported) لذلك فان الاشعاع المنبعث من البروب يكون واطئ او ضعيف في الظروف الطبيعية, عندما يبدئ الجهاز بالعمل وتبدأ اشرطة الDNA بالتضاعف يبدأ البروب بالارتباط مع الجين المطلوب لكن سرعان ما ينشطر وينفلق بفعل انزيم البوليميريز(Polymerase) لذلك فان ال(Reported) وال(quencher) سوف ينفصلان فيزيائيا ثم سيتزايد انبعاث الاشعاع بسبب ابتعاد quencherعن Reported حيث يبدأ الاخير بالاشعاع بصورة طبيعية.




الترحيل الكهربائي في هلام الاكاروز
Agarose Gel electrophoresis :
الترحيل الكهربائي
تقنية تستخدم لعزل المواد حسب معدل حركتها تحت تأثير المجال الكهربائي
يستعمل الجل المكون من مادة الاكاروز- وهي مادة مأخوذة من نباتات بحرية-,حيث يتم عمل شريحة الاكاروز عن طريق اذابة المادة في محلول منظم وتسخينه حتى يصبح المحلول صافيا تماما
ومن ثم صب الاكاروز في إناء خاص حتى يبرد مما ينتج عنه مادة جيلاتينية مرنة يتم استخدامها
في عملية الفصل, وإثناء عملية الفصل توضع الشريحة الجيلاتينية داخل وعاء يحوي محلول منظم
وفيه قطبان (سالب وموجب).
يتم تحليل الحمض النووي عن طريق وضعه في فتحات خاصة في الجل ومن ثم دفعه للامام بوساطة
فرق جهد كهربائي فيبدأ الحمض النووي بالانتقال الى القطب الموجب من القطب السالب
وهذا يكون تحت عدة عوامل منها:-.
1- قوة فرق الجهد The applied voltage..
2- تركيز الاكاروز The concentration .
3- حجم قطعة الحمض النوويThe moleculae size of DNA
فكلما كانت اصغر كانت اسرع .
2- هيئة الـDNA . The conformation of DNA
4- نوعية وحالة الاكاروز.
عادةٍ تستخدم وحدة الترحيل الافقية لهلام الاكاروز,والحمض النووي ذاته غير مرئي في الهلام لهذا يتم صبغه بمادة ترتبط به قبل وضع العينات في الجل ومن امثلتها مادة الاثيديوم برومايد التي تتألق عند تعرضها للأشعة فوق البنفسجية.
المواد: اكاروز,بفرالترحيل TBE,ماء مقطر, بفر التحميل Loading buffer (بروموفينول بلو + سكروز),بروميد الاثيديم,عينات الـDNA المستخلصة
طريقة العمل: يذاب 0.7 غم من الاكاروز في 100 مل من بفر الـ TBE وبعد التسخين إلى درجة 100 م° ويبرد إلى درجة 50 م تقريبا ثم يضاف إليه 5 مايكروليتر من محلول صبغة بروميد الاثيديوم ( Ethidium Bromide) (بتركيز 5 ملغم / مل) .
1) تحضر صفيحة إسناد الاكاروز (Tray) الزجاجية ويصب الهلام بعد غمس مشط الحفــر(Comb) قرب إحدى نهايتي الصفيحة ويترك الاكاروز ليتصلب بوضع أفقي لمدة 30 دقيقة تقريباً او اقل.
2) يرفع المشط من الهلام المتصلب ثم ثبتت الصفيحة على مساندها في وحدة الترحيل الأفقية ويغطى الاكاروز المتصلب بمحلول الـ TBE .
3) يتم تحميل DNA داخل الحفر المتكونة كالآتي : مزج 7 ما يكروليتر تقريباً من الـ DNA مع 3 مـا يكروليتر مـن محلول دارئ(بفر) التحميل (Loading buffer) وتمزج المحتويات بشكل جيد ثم تملىء في الحفر المخصصة ،ترحل العينات بجهد كهربائي يقارب 7 فولت / سم ولمدة 1-2 ساعة حتى بلوغ الصبغة الدالة قرب نهاية الهلام .
4) يتم التقصي عن الـ DNA بعد تعريض الهلام إلى الأشعة فوق البنفسجية بوساطة جهاز UV transilluminator.



تفاعل البلمرة المتسلسل
( Polymerase Chain Reaction PCR)

تفاعل البلمرة المتسلسل -:(PCR) هو عبارة عن تضخيم جزيئة واحدة أو بضع نسخ من قطعة من الحمض النووي عبر عدة أوامر، لتوليد آلاف الملايين من النسخ من تسلسل الحمض النووي بصفة خاصة ,وهي تقنية لايمكن الغنى عنها في كثير من الأحيان تستخدم في مختبرات البحوث الطبية والبيولوجية لمجموعة متنوعة من التطبيقات.
وتشمل هذه الطريقة استنساخ DNA وتكثيره لغرض التحليل الوظيفي للجينات ، وتشخيص الأمراض الوراثية ، وتحديد البصمات الوراثية (المستخدمة في علوم الطب الشرعي واختبار الأبوة) ، وكشف وتشخيص الأمراض المعدية. في عام 1993 ، منحت موليس جائزة نوبل في الكيمياء لمايكل سميث لعمله على PCR حيث ان أسلوب عمله يعتمد على الدرجات الحرارية ، ويتألف من دورات التسخين والتبريد المتكررة للتفاعل مع الحمض النووي.
ان الهدف من استخدام تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل Polymerase Chain Reaction (PCR) هو لتضخيم عدد نسخ الجين للوصول الى عدد معين من النسخ لاستعماله كقالب لتكثير وتضاعف DNA.
يمكن اجمال عمل الفحص كالاتي :-
تفاعل الدورات The cycling rection
هناك ثلاث مراحل رئيسية في تفاعل (PCR) والتي تتكرر حوالي 30 الى 40 مرة وهذه المراحل تحدث في جهاز الدورات الاوتوماتيكي والذي يستطيع ان يهيئ ظروف حرارة وتبريد على التوالي للانابيب الخاصة بالجهاز لبدء التفاعلات الخاصة بنسخ الجين المطلوب في وقت قصير.
1-مسخ الجين Denaturation عند درجةC ?94
بعد بدء عملية النسخ تبدا الجديلة المزدوجة للDNA بالتباعد والانفتاح لينتج خيطان مفردان من نفس الجين الاصلي .
2- مرحلة الالتئامAnnealing عند درجة C? 54
يبدا البرايمر Primers بالاهتزاز والاقتراب من القالب Template حيث يكون هذا الاهتزاز على شكل حركة بروانية Brownian motion حيث تبدا اصرة ايونية بالتكوين بين الشريط المفرد من البرايمر والقالب ,وهنا يعمل انزيم البوليميريز على بدء النسخ للقالب لتكوين نسخ جديدة كثيرة, ان الاصرة الايونية بين البرايمر والقالب تكون قوية جدا بحيث يصعب تفككها في درجات الحرارة الاعتيادية .
3-التمدد Extension عند درجة C ? 72
تعتبر هذ الدرجة هي الدرجة المثالية لعمل انزيم البوليميريز حيث تبدا هنا القواعد النتروجينية بالاضافة بواسطة البوليميريز (اضافة المتمم للقالبComplementary to the template) وبهذه الطريقة تبدا اشرطة الDNA بالتضاعف والتزايد الاسي حيث تتضاعف من شريط واحد (القالب Template)الى شريطين ثم اربعة ثم ثمانية اشرطة وهكذا.
تضاف المواد الكيمياوية التالية الى العينة وحسب الكميات المذكورة في الجدول:-

المادة الكيمياوية الحجم
Master mix lµ 12.5
DNA lµ 4
Forward primer lµ 1.5
Revers primer lµ 1.5
Deionizer D.W. lµ 5.5
Total lµ 25

يضبط مراحل وعدد دورات جهاز Thermo cycler حسب الجدول الاتي :
Extension Annealing Stage 2 Stage 1
? 70 ? 70 ? 54 ? 95 ? 95
7 min 1 min 1 min 30 sec 5 min
35 cycle