تفاعل البلمرة المتسلسل(الوقت الحقيقي)

تفاعل البلمرة المتسلسل(الوقت الحقيقي)
Real-Time PCR
تفاعل البلمرة المتسلسل(الوقت الحقيقي)
هو تفاعل تضاعف وتزايد في اعداد نسخ قطع DNA الهدف مع وجود كاميرا او كاشف(الصبغات المشعة) يدون ويرصد هذه العمليات لأجل اعطاء تقرير مفصل عن عدد الدورات ومايقابلها من تزايد وتضخم لنسخ الجين الهدف.
هناك العديد من الطرق التي نستطيع من خلالها متابعة ورصد تضاعف الـDNA في العينة اذ تستعمل المعلمات المشعة (fluorescent marker) للارتباط مع DNA المتضاعف وكلما زادت اشرطة DNA المنسوخة زاد استعمال الصبغة المشعة .لذلك تعتبر استعمال هذه التقنية مفيد جدا بسبب القدرة على مشاهدة عمليات التضاعف والاستغناء عن عملية ترحيل ال DNA في الاكاروز.

اهم الطرق التي تساعدنا في رصد تضخم الـ DNA :-
1- الصبغات المضيئة (Fluorescent dyes) :-
ان استعمال الصبغة المشعة في تقنية RT-PCR يعتبر الارخص والابسط لرصد التضاعف حيث ان ارتباط هذه الصبغة يتزايد مع تزايد اشرطة DNA المزدوجة المنسوخة حديثا ,لكن الغير مفيد في هذه الطريقة هو ان الصبغة ترتبط مع اي تضاعف لاشرطة DNA بدون تخصص (specificity.) للجين المطلوب.

2- البروب المشع (Fluorescent probes) :-
البروب المشع هو قطعة من الDNA متممة للجين المطلوب تضخيمه وتكاثره حيث تكون معلمة بالصبغة المشعة.
يعد التاكمان(Taqman) البروب الابسط والاكثر شيوعا حيث يتكون من قطعه من الDNA تحتوي على جزيئة (Reported) مشع في احد الاطراف وجزيئة (quencher) ماصة للاشعاع في طرفها الاخر (تمتص الاشعة المنبعثة من الجزيئة الباعثة للاشعاع (Reported) لذلك فان الاشعاع المنبعث من البروب يكون واطئ او ضعيف في الظروف الطبيعية, عندما يبدئ الجهاز بالعمل وتبدأ اشرطة الDNA بالتضاعف يبدأ البروب بالارتباط مع الجين المطلوب لكن سرعان ما ينشطر وينفلق بفعل انزيم البوليميريز(Polymerase) لذلك فان ال(Reported) وال(quencher) سوف ينفصلان فيزيائيا ثم سيتزايد انبعاث الاشعاع بسبب ابتعاد quencherعن Reported حيث يبدأ الاخير بالاشعاع بصورة طبيعية.


تقدير الاحماض النووية Nucleic acid quantitation
تعد تقدير الحامض النووي في العينة عملية مهمة لتحديد مقدار تركيز الـDNA و RNA في العينة ودرجة نقاوته حيث تعتمد على هذه العملية الكثير من الفحوصات والتفاعلات الخاصة
بالـ DNA مثل جهاز PCR واجهزة وراثية اخرى .
هناك العديد من الطرق المستعملة لقياس DNA في العينة منها:
1. جهاز المطياف الضوئي spectrophotometer
2. جهاز Nanodrop

جهاز Nanodrop
يعتبر قياس الحامض النووي (DNA او RNA) في هذا الجهاز عملية سهلة وسريعة اضافة الى انها تكشف لنا عن نسبة الخطأ المحتمل وجودها في العينة حيث ان القراءات القياسية للحامض النووي هي كالاتي:
DNA= 1.8 ~
RNA= 2.0 ~
اما القراءات التي تختلف عن هذه النسب فهي دلالة على وجود تلوث في العينة, اي ان العينة لازالت حاوية على البروتين او بعض المواد الاخرى .تتم القراءة عند طول موجيnm 260 -280 .

طريقة عمل الجهاز:
1- اختر الايقونة الخاصة بالجهاز(Nanodrope) الموجودة على سطح المكتب.
2- اختر Nucleic acid من القائمة .
3- اختر نوع الحامض النووي DNA ,
4- اختر الوحدة القياسية الخاصة بالحامض النووي وهي ng/µL.
5- اختر الطول الموجي الملائم للمحلول المراد فحصه,ان الطول الموجي 280-260 هو الملائم لقياس وتقدير الحامض النووي.
6- اختر الايكونه (add to the report) لاضافة جميع القياسات الخاصة بجميع عيناتك وحفظها لحين الرجوع اليها عند الحاجة.
7- صفر الجهاز بواسطة (Blank المحلول المذيب للحامض النووي).يجب ان يكون هذا المحلول مذيب جيد للحامض النووي اضافة الى ان الـBlank المستعمل لتصفير الجهاز يجب ان يكون بنفس درجة pH ونفس الدرجة الايونية للمحلول المستعمل للمذيب للحامض النووي (DNA).
8- ضع 1-2 lµ من محلول البلانك على عدسة الجهاز ثم انزل ذراع الجهاز.ثم اضغط على كلمة(blank )
9- نظف العدسة بورق التنظيف الخاص ثم ضع العينة واضغط على كلمة (Measure) ليبدء الجهاز بالقياس.