المختبر الثاني عملي 2016

ان اي دراسة وراثيه للكائنات الحيه تتطلب استخلاص (استخراج) جزيئة DNA نقية من العينة البيولوجية لغرض استخدامها في الدراسات الوراثية المختلفة لذلك فقد قام العلماء والباحثين بتطوير عدد من الطرق لاستخلاص الدنا تختلف في اسسها ومتطلباتها ولكل منها محاسن ومساوئ وهي كمايلي
1- طريقة المذيبات العضوية Organic solvent Method
2- طريقة التمليح الخارجي Salting out Method
3- طريقه مرشحات السيليكا Silica Membrane Method
4- طريقة المبادلات الايونية Chelix Method

مراحل عملية الاستخلاص: Basic Steps of DNA Extraction
بصوره عامه اي عملية استخلاص تمر بالمراحل التالية:
1- تهيئة الخلايا او العينة Sample or Cell preparation
ان اي عينه بيولوجية يراد استخلاص الدنا منها يجب ان يتم تحضيرها وتهيئتها لعملية الاستخلاص وكما يلي:

*عينة الدم : يتم من خلال سحب الدم في tube EDTA وليس heparin tube ؟
*عينة القشع: تعامل معامله خاصه بمادة تسمى ب liquefier ومثالها (NaOH-NALC) لتفكيك المواد المخاطية مما يسهل ازالتها والتخلص منها.
*عينة البكتريا: اذا كانت مستعمرات نامية على وسط صلب فيتم قشطها واعادة تعليقها بماده PBS ومن ثم تخلط. اذا كانت نامية في وسط لوريا Luria Broth فيتم عمل سنترفيوج لترسيب البكتريا واهمال الرائق واخذ راسب البكتريا المعلق بكمية من LB ومن ثم ينقل الى تيوب 1.5ml وعمل سنترفيوج واهمال الرائق.
(NaOH-NALC)= sodium hydroxide + N, acetyl L-cysteine
*عينة العظم: يستخدم التنظيف الميكانيكي بأداة حاده ومن ثم يستخدم هايبوكلورات الصوديوم لإزالة المواد العالقة بالعظم ومن ثم يقص جزي من العظم ويطحن ونهيئ العالق باستخدام PBS

2- غسل الخلايا Cells Wash
تغسل الخلايا باستخدام محلول PBS ؟ على الاقل ثلاث مرات ومن ثم نعمل سنترفيوج لإهمال الرائق واخذ الخلايا المترسبة. تمثل هذه الخطوة مع الخطوة السابقة عملية ال cell harvesting

3- تحليل الجدار او الغشاء الحيوي Cell wall and membrane lysis
تعتمد هذه الخطوة على نوع الخلية المراد استخلاص الدنا منها حيث تختلف الخلايا البكتيرية عن الحيوانية وكذلك عن النباتية وبالتالي فان المواد المستخدمة تختلف.
#للخلايا صعبة التحلل مثل خلايا الحشرات والنبات والفطريات يفضل استخدام ال cooling shock باستخدام ال liquid nitrogen .
نتيجة لهذه الخطوة سنحصل على حلالة الخلايا cell lysate الذي يحتوي على كل المكونات الخلوية بضمنها ال DNA .

4- مسخ البروتينات والانزيمات و ازاله الشوائب Protein precipitation
للتخلص من كل المكونات الخلوية عدا الدنا يتوجب علينا مسخ البروتينات والتخلص من الدهون وتمتاز هذه الخطوة بانها عامة حيث تستخدم مواد معينه لك انواع العينات المستخدمة. ان مسخ البروتينات والفوسفولبيد هو فقدان ذائبية هذه المواد وبالتالي يمكن ترسيبها وفصلها وبقاء الدنا ذائب في المحلول المائي وبالتالي تسحب الطبقة المائية الحاوية على الدنا للخطوات اللاحقة لترسيب الدنا.

5- ترسيب الـ DNA باستخدام الكحولات Dehydration
ويتم ذلك من خلال استخدام كحول الايثانول او الايزوبروبانول اوالكحول الايزواميلي والذي يعمل بدوره على عملية سحب الماء Dehydration وترسيب الدنا.

6- غسل جزيئات الحامض النووي Washing
ويتم ذلك من خلال استخدام كحول الايثانول او الايزوبروبانول اوالكحول الايزواميلي والذي يعمل بدوره على عملية سحب الماء Dehydration وبالتالي غسل الدنا.

7- اعاده جزيئات الحامض النووي الى حالتها الذائبة Rehydration
ويتم ذلك من خلال استخدام دارئ TE (pH 8.4) والذي بدوره يحافظ على الدنا بالهيئة الذائبة