مفهوم التخمر fermentation

مفهوم التخمر fermentation:

كانت كلمة " تخمر" تشير في بداية استعمالها الى التفاعلات الكيميائية التي يتكون فيها غاز على سطح وسط النمو و الذي ينشأ نتيجة ذلك كمية من الفقاعات الهوائية . اشتقت كمة التخمر بالانكليزية : fermentation من الفعل اللاتيني (fervere) والذي يعني "الغليان " Boiling . وقد استخدم هذا المصطلح لأول مرةٍ في أواخر القرن الرابع عشر في الكيمياء، وكان متداولاً على مدى واسع النطاق. إلا أنه لم يُستخدم في الاوساط العلمية حتى بداية القرن الخامس عشر , وقد توسع هذا المصطلح كثيراً فيما بعد ليشمل كل التفاعلات الكيمياوية المصاحبة للاكسدة والاختزال والتي تقوم بها الاحياء المجهرية او الانزيمات المايكروبية والتي تكون فيها المركبات العضوية اما واهبة او مستقبلة لايونات الهيدروجين . والمركبات المستقبلة لايونات الهيدروجين هي التي ستتراكم لتكون نواتج التخمر . ويمكن الاستفادة من نواتج التخمر هذه في تشخيص وتصنيف البكتريا ومثال على ذلك تصنيف سلالات جنس Lactobacillus حيث يمكن تشخيص الانواع التابعة لها او تقسيمها الى مجموعتين هما:-

1- Homo fermentation lactobacilli

2- Hetero fermentation lactobacilli

Homo fermentation lactobacilli :- والتي تستخدم في انتاج حامض اللاكتيك من تخمر الكلوكوز وبنسب عالية قد تصل في بعض السلالات الى 100% من خلال دورة الكلاكوليسز glycolysis , وعادة ما تمتلك هذه السلالات انزيم (aldolase) بشكل فعال و الذي يعمل على شطر مركب ِ Fructose bisphosphate الى جزئين من السكريات الثلاثية المفسفرة.

Hetero fermentation lactobacilli :- تنتج هذه الانواع عدة انواع من النواتج الثانوية مثل الايثانول والكليسرول وحامض الخليك وغاز CO2 بالاضافة الى حامض اللاكتيك , وبسبب عدم احتواءها على انزيم aldolase فان عملية تحطيم الكلوكوز تتم من خلال دورة pentose phosphate pathway وتكوين سكر خماسي مفسفر هو Ribulose-p :



Glucose ? glucose- 6- p ? 6-p-glaconate


Ribulose 5-p +CO2


Acetyl phosphate 3-p- glyceraldehyed


Acetic acid ethanol pyruvate glycerol


Lactic acid


وكما ذكر انفا فان كلمة التخمر استخدمت سابقا للاشارة الى هذه التفاعلات اللاهوائية, لكنها الان في الصناعات التخمرية فان استخدام كلمة تخمر:- تشمل التفاعلات التي يحدث فيها تغيير كيمياوي للمركبات بفعل الانزيمات ذات الاصل الجرثومي لذا فحتى العمليات الهوائية مثل انتاج حامض الكلوكونك اسد gluconic acid من الكلوكوز في مزرعة الفطر Aspergillus niger وكذلك انتاج مركب dihydroxyaceton من نمو بكتريا Acetobacter suboxydans وكذلك من ِA.xylinum .

كيميائية التخمر:
تحتوى منتجات التخمر على طاقةٍ كيميائيةٍ (تتسم بأنها ليست مؤكسدة تماماً)، إلا أنها تُعتبر منتجات نفايات، حيث أنها لا يمكن تمثيلها أكثر من ذلك بدون استخدام الأوكسجين (أو أي متقبلات الإلكترون عالية الاكسدة الأخرى). نتيجةً لذلك فإن إنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات من خلال عملية التخمر تكون أقل كفايةٍ من الفسفرة التأكسدية، في حين يتأكسد البيروفات تماماً إلى ثاني أكسيد الكربون .

يعمل ُ تخمر الإيثانول ) Ethanol fermentation والذي تنفذه الخميرة وأنواعٍ أخرى من البكتريا) على تكسير حامض البيروفك pyruvic acid إلى الإيثانول وثاني أكسيد الكربون. وهو يلعب دوراهاما في صناعة الخبز، تخمر المعجنات ، وكذلك في صناعة الخل. وغالباً ما يُفضل واحداً من المنتجات؛ فعلى سبيل المثال في صناعة الخبز، يستخرج الكحول من الخبز، وفي إنتاج الكحول، ينطلق ثاني أكسيد الكربون إلى الغلاف الجوي المحيط أو يُسْتَخْدَم لكربنة المشروبات المنعشة. وعندما يكون للبكتين تركيزاً عالياً في المخمر، يتم إنتاج كمياتٍ صغيرةٍ من الميثانول. و تلخص المعادلة الكيميائية التالية عملية تخمر الكلوكوز. حيث يتحول جزيء واحد من الكلوكوز إلى جزيئين من الإيثانول وجزيئين آخرين من ثاني أوكسيد الكربون:
C6H12O6 ? 2C2H5OH + 2CO2
ونلاحظ أن الصيغة الكيميائية للإيثانول هي: C2H5OH
و قبل وقوع عملية التخمر، يتم تكسير جزيءكلوكوز واحد إلى جزيئين من حامض البايروفك اسد , وتعرف تلك العملية باسم التحلل السكري.

تعبر عملية تخمر حامض اللاكتيك أو حمض اللبن عن أبسط صور التخمر. حيث أنها أساساً عبارة عن صورة من صور تفاعلات الأكسدة- الاختزال وهي تحدث في ظروف لا هوائيه ولكن الاكسده تحدث في ظروف هوائيه. ففي ظل الأجواء اللاهوائية، تتمثل الآلية الأساسية لإنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات في عملية التحلل السكري. حيث تقلص- تحول عملية التحلل السكري الإلكترونات إلى NAD+ ، مما يؤدي الى تكوين NADH. على الرغم من ذلك، لا يتوافر سوى موردٍ محدودٍ للـ NAD+ في الخلية. ومن أجل استمرار عملية التحلل السكري، يجب أن يتم أكسدة NADH – أي يتم أخذ الإلكترونات بعيداً عنها – بهدف إعادة إنتاج NAD+. وغالباً ما تقع تلك العملية من خلال سلسلة نقل الإلكترون ضمن عمليةٍ يطلق عليها الفسفرة التأكسدية؛ على الرغم من ذلك، بدون توفير الأكسجين لا يمكن إتمام تلك العملية.
وبدلاً من ذلك، يمنح NADH الإلكترونات الإضافية الزائدة لجزيئات حامض البيروفك والتي تكونت خلال عملية التحلل السكري. وبما أن NADH يفقد إلكتروناته، يعاد إنتاج NAD+ والذي يصبح متاحاً مرةً أخرى لعملية التحلل السكري. وهنا يتكون حامض اللاكتيك، والذي سميت تلك العملية باسمه، من خلال تقليل أو تقلص حامض البايروفك.
ولا يتحول سوى جزيء واحد لحامض البيروفك إلى لاكتات lactate في عملية تخمر حامض اللاكتيك المغاير heterolactic acid؛ في حين يتحول الجزيء الآخر إلى إيثانول وثاني أكسيد الكربون. أما في عملية تخمر حامض اللاكتيك المماثل homolactic acid ، فإن كلا جزئي حامض البايروفك تتحول إلى لاكتات. مما يجعل من عملية تخمر حامض اللاكتيك الصرف عمليةً فريدةً بسبب أنها واحدةٌ من عمليات التنفس والتي لا تنتج غازاً كمنتجٍ ثانويٍ.
تُكَسِّر عملية تخمر اللاكتيك الصرف حامض البيروفك إلى اللاكتات (lactate). وتحصل في عضلات الحيوانات عندما تحتاج إلى طاقةٍ أسرع من الدم الذي يمدها بالأوكسجين. كما أنها قد تحصل كذلك في بعض أنواع البكتريا (مثل بكتريا العصيات اللبنية (lactobacilli)) وبعض أنواع الفطريات. فهي تعبر عن ذلك النوع من البكتريا الذي يقوم بتحويل اللاكتوز إلى حامض اللاكتيك في اللبن الرائب، والذي يُكْسِبَه نكهته ومذاقه الحامضين. ويمكن تصنيف بكتريا الحامض اللاكتيكي تلك كبكتريا تخمرية صرفة، حيث يكون المنتج النهائي في أغلب الأحيان اللاكتات، أو كبكتريا تخمرية مغايرة، حيث يستقلب أو يتمثل بعضاً من اللاكتات أبعد من ذلك، وينتج عن ذلك إنتاج ثاني أكسيد الكربون واملاح الخلات وبعض المنتجات المؤيضة الأخرى.
تتلخص عملية تخمر حامض اللاكتيك باستخدام الكلوكوز، حيث يتحول جزيء واحد فقط للكلوكوز، في عملية التخمر اللبني الصرف، إلى جزيء واحد فقط من حامض اللاكتيك و جزيء واحد فقط من الإيثانول، وجزيء واحد آخر من ثاني أكسيد الكربون، كما يلي:
C6H12O6 ? CH3CHOHCOOH + C2H5OH + CO2
مع ملاحظة أنه قبيل وقوع عملية التخمر اللبني الصرف، يجب انقسام جزيء الكلوكوز إلى جزيئين من حامض البايروفك. ويطلق على تلك العملية التحلل السكري.
ولاستخلاص الطاقة الكيميائية من الكلوكوز، لابد من انقسام الكلوكوز إلى جزيئين من البايروفات. تسفر تلك العملية كذلك عن إنتاج جزيئين من أدينوسين ثلاثي الفوسفات كحصيلةٍ للطاقة الفورية بالإضافة إلى جزيئين من ثنائي نيكليوتيدة الأدنين وأميد النيكوتنك ] NADH] ]:
C6H12O6 + 2 ADP + 2 Pi + 2 NAD+ ? 2 CH3COCOO? + 2 ATP + 2 NADH + 2 H2O + 2H+

وتتمثل الصيغة الكيميائية لحامض البيروفات بالشكل CH3COCOO-- .وتشير pi الى الفوسفات غير العضوي . وكما ظهر أمامنا في المعادلة الكيميائية، فان التحلل السكري يسبب تقلصٍ لجزيئين من NAD+ إلى NADH ويتحول جزيئين من أدينوسين ثنائي الفوسفات Adenosine diphosphate إلى جزيئين من أدينوسين ثلاثي الفوسفات وجزيئين ماء من خلال عملية فسفرة على مستوى المادة الاساس phosphorylation . substrate-level ويُنْتَج غاز الهيدروجين في العديد من عمليات التخمر (تخمر الحامض المختلط (mixed acid fermentation))، و تخمر حامض بيوتريك (butyric acid) ,و تخمر الكابروات (caproate)، تخمر الغليوكسيلات (glyoxylate) وتخمر البوتانول (butanol))، وذلك كطريقةٍ لإنتاج NAD+ من NADH. وتنتقل الإلكترونات إلى الفيريدوكسين، والتي تتأكسد بدورها بواسطة انزيم الهيدروجينيز hydrogenase، مما يُنْتِج جزيء الهيدروجين [H2] وهنا يُسْتخدم غاز الهيدروجين كمادة اساس ٍ لتنمية البكتريا المنتجة للميثان (methanogens) ، والتي تحافظ على تركيز الهيدروجين منخفضاً بصورةٍ كافيةٍ للسماح بإنتاج مثل ذلك المركب الغني بالطاقة.

وعلى الرغم من أن توضيح أن عملية التخمر كانت عموماً نتيجة تفاعل الكائنات الحية الدقيقة يمثل تقدماً هائلاً في المعرفة في ذلك الوقت، إلا أنه لم يتم توضيح الطبيعة الأساسية لعملية التخمر ذاتها، أو حتى إثبات أنها تقع بواسطة الكائنات الدقيقة والتي كانت دائماً موجودة بصورةٍ واضحةٍ. حيث حاول العديد من العلماء، ومن بينهم باستير، بنجاح استخلاص إنزيم التخمر من الخميرة.[14] وقد واتتهم جميعاً الفرصة الناجحة عندما تمكن الكيميائي الألماني إدوارد بوشنار عام 1897من حصر الخميرة، واستخلاص عصيرٍ منها، ثم وجد ما أدهشه أن هذا السائل "الميت" له القدرة على تخمير محلول سكري، مكوناً ثاني أكسيد الكربون والكحول مثله مثله الخميرة الحية بصورةٍ كبيرةٍ.[15] حيث تصرفت "المخمرات" المجهولة وتفاعلت مثلها مثل المخمرات المنظمة تماماً. ومنذ ذلك الوقت تم استخداممصطلح الإنزيم وتطبيقه على كل المخمرات. ثم تم استيعاب بعد ذلك أن عملية التخمر تسببها إنزيمات تنتجها كائناتٍ دقيقةٍ.[16] وفي عام 1908 حصل بوشنر علىجائزة نوبل العالمية في الكيمياء لإنجازاته في ذلك المجال.[17]
وعلى الرغم من أن توضيح أن عملية التخمر كانت عموماً نتيجة تفاعل الكائنات الحية الدقيقة يمثل تقدماً هائلاً في المعرفة في ذلك الوقت، إلا أنه لم يتم توضيح الطبيعة الأساسية لعملية التخمر ذاتها، أو حتى إثبات أنها تقع بواسطة الكائنات الدقيقة والتي كانت دائماً موجودة بصورةٍ واضحةٍ. حيث حاول العديد من العلماء، ومن بينهم باستير، بنجاح استخلاص إنزيم التخمر من الخميرة.[14] وقد واتتهم جميعاً الفرصة الناجحة عندما تمكن الكيميائي الألماني إدوارد بوشنار عام 1897 من حصر الخميرة، واستخلاص عصيرٍ منها، ثم وجد ما أدهشه أن هذا السائل "الميت" له القدرة على تخمير محلول سكري، مكوناً ثاني أكسيد الكربون والكحول مثله مثله الخميرة الحية بصورةٍ كبيرةٍ.[15] حيث تصرفت "المخمرات" المجهولة وتفاعلت مثلها مثل المخمرات المنظمة تماماً. ومنذ ذلك الوقت تم استخداممصطلح الإنزيم وتطبيقه على كل المخمرات. ثم تم استيعاب بعد ذلك أن عملية التخمر تسببها إنزيمات تنتجها كائناتٍ دقيقةٍ.[16] وفي عام 1908 حصل بوشنر على جائزة نوبل العالمية في الكيمياء لإنجازاته في ذلك المجال.[17]
كما استمرت التقدمات والإنجازات تتوالى في مجالي الكائنات الدقيقة والتخمر بصورةٍ ثابتةٍ حتى وقتنا هذا. وعلى سبيل المثال، في أواخر السبعينات من القرن العشرين تم اكتشاف أن الكائنات الدقيقة لها القدرة على التحور بمساعدة المعالجات الفيزيائية والكيميائية لتنتج نواتج ايضية مهمة وبتراكيز أعلى، ونمواً اسرع، وتصبح أكثر قدرةً على التعايش في أجواء الأوكسجين المنخفض، بالإضافة إلى أنها تصبح قادرةً على استخدام وسيطاً أكثر تركزاً. هذا بالإضافة إلى أنه تم انتقاء سلالاتٍ وتطوير تهجيناتٍ أفضل، مؤثرةً جميعها على أغلب صور تخمرات الأطعمة الحديثة والعصرية.



البحث عن سلالات جديدة

ان عملية البحث عن سلالات بكتيرية جديدة تعني محاولة اكتشاف انواع مايكروبية جديدة –منتجة للانزيمات المطلوبة وبمستويات عالية بالاضافة الى الصفات الاخرى مثل:- القدرة على النمو في اوساط معينة وتحت ظروف خاصة لانتاج كميات كبيرة في الناتج المطلوب وقد اكتشاف هذه السلالات عن طريق الصدفة كما حصل للعالم Fleming عندما عزل بطريق الصدفة الفطر Penicillium- المنتج للمضاد الحياتي البنسيلين والذي لون سطح طبق مزروع ببكتريا Staphylococcus . أو عن طريق استخدام تقنيات خاصة بالبحث مثل:-

1- طريقة الطبق المزدحم Crowded plate technique :
وتتضمن لهذه الطريقة البسيطة التي تستعمل للتحري عن السلالات القادرة على انتاج المضادات الحياتية .
ينشر سلسلة من التخافيف لمعلق التربة على سطح اكار مغذي وتحضن بدرجة حرارة مناسبة , ثم تؤخذ الاطباق التي تحتوي على 100-300 مستعمرة وتغمر في معلق من بكتريا مرضية تسمى test organism يراد البحث عن مضاد حيوي فعال ضدها وتحضن الاطباق مرة ثانية والمستعمرات من معلق التربة التي يظهر حولها منطقة انعدام النمو يتم تنقيتها ودراسة قابليتها على انتاج المضاد الحياتية Antibiotics .



2- Auxanography :
هذه الطريقة تستخدم للتحري عن سلالات تنتج عوامل نمو خاصة وتعتمد هذه الطريقة ، بوضع شريط من ورقة ترشيح على سطح طبق فارغ بحيث تكون نهايات الشريط حرة من الجانبين ويوضع قرص من نفس ورقة الترشيح على الشريط في باطن الطبق ويصب فوقه وسط أكار مغذي.
وبعد التصلب يصب معلق من التربة بحيث ينتج عنها نمو مستعمرات منفصلة ومعزولة . ومن ناحية اخرى يتم تحضير طبق اخر مزروع بكتريا معينة تسمى Indicator organism.
Indicator organism :- وهي عبارة عن بكتريا فيها طفرة غذائية auxotroph اي ليست لها القابلية على انتاج عامل نمو معين مما يعني انها تحتاج الى اضافة هذا العامل الى وسط النمو مثل حامض اميني او فيتامين غير موجود في الوسط الادنى والذي يسمى minimal medium لذا فالبكتريا لا تنمو على الطبق الا بوجود هذا العامل . وعندما يبرد الطبق الثاني يتم رفع محتويات الطبق الاول ووضعه على سطح الطبق الثاني دون قلبه والمواد الغذائية المنتجة من قبل البكتريا في الطبق الاول تنزل من الطبق الاول الى الثاني بعملية الانتشار diffusion. والمستعمرات التي تحتاج الى عوامل للنمو ستنمو حول المستعمرات بشكل Subculture بين الطبقتين.
3- الزرع الاغنائي Enrichment culture :
البيئات الطبيعية تضم احياء مجهرية مختلفة لقدرتها على تمثيل المركبات ، وتتعايش هذه الاحياء بفعل قدرة كل نوع على استهلاك جزء من المركبات وقد تكون نواتج تمثيل نوع معين تفيد في نمو نوع أخر. لذا اذا زرعت مجموعة احياء في مزرعة تحتوي على مركب واحد اساسي ، مصدر وحيد للكاربون او النتروجين او الطاقة فان الانواع القادرة على استهلاك ذلك المركب ستنمو بسرعة مما يزيد اعدادها في المزرعة. وقد يصاحب نموها نمو انواع أخرى تنمو على نواتج التمثيل ولكن بأعداد اقل، واذا اعيدت عملية الزرع اكثر من مرة فان اعداد النوع الاول ستصبح هي السائدة وبالتالي يمكن عزلها بشكل نقي.


صفات السلالات المهمة في التخمرات الصناعية:-
1- السلالة يجب ان تكون ثابته وراثياً , والسلالة التي تنتج بشكل ثابت وذاتي واحد او اكثر من النواتج المختلفة او غير مطلوية لا تكون هذه السلالة مرغوب فيها.
2- السلالة يجب ان تنتج وبسرعة العديد من الخلايا الخضرية ، السبورات او الوحدات التكاثرية الاخرى.
3- السلالة يجب ان تنمو بشده وبسرعة بعد عملية تلقيحها سواء بالمخمر او بالاوعية الخاصة لتحضير اللقاح.
4- السلالة يجب ان تكون نقية ليس فقط من باقي الاحياء المجهرية التي يمكن تمييزها مجهرياً وانما خالية من الـ phage .
5- السلالة قادرة على انتاج الناتج المطلوب خلال فترة قصيرة ويفضل 3 ايام او اقل.
6- السلالة يجب ان تنتج الناتج المطلوب دون تكوين مواد سامة من السموم وفي حالة انتاج اكثر من مركب فيجب ان يكون المنتوج المطلوب سهل الفصل عن غيره.
7- الاسpH واطئ او درجات حرارة عالية اوتنتج مواد مثبطة للانواع الاخرى بسرعة.
8- تكون السلالة سهلة الحفظ ولفترات زمنية طويلة.
9- تكون السلالة ذات قابلية على احداث طفرات وراثية مستحثة باستعمال عوامل التطفير وذلك من اجل تحسين صفاتها وزيادة انتاجيتها.
10- السلالة يجب ان تعطي كميات محسوسة من الناتج المطلوب خلال فترة تخمر محددة.

المكونات الاساسية لوحدة التخمر Fermentation unit components :

1- وحدات تجميع العزلات (مختبر التجميع) Culture collection lab:-

وهذا يجهز العزلات المطلوبة لبدء أي عملية تخمرية وايضاً اجراء اختبارات النقاوة sterility tests .

2- مختبر السيطرة Control lab:-
وهذا يقوم بمتابعة كل عملية تخمرية من خلال الحسابات الكيمياوية للسكريات المختزلة او السكريات المتحللة او المركبات النتروجينية والباقية وبنفس الوقت اجراء قياسات الاس الهيدروجيني ووزن المايسليوم للفطر المستخدم في عملية التخمر.



3- مخزن المكونات ingredient store :
وهذه تخزن كميات كبيرة من المواد المستعملة في عمليات التخمير وتشمل السكريات المذيبات والاوساط الزرعية، اوساط التخمير وغيرها.

4- مختبر البحوث investigation lab :
ويجري الفحوصات المايكروبايولوجية والكيميائية وكذلك الدراسات وتقيم الحالة الكيمياوية العملية الاستخلاص واعطاء التصورات حول زمان الناتج وتقييم كفاءة الاستخلاص وكذلك تهيئة المستلزمات عند الضرورة لاجراء عملية التخمير في مختبرات صغيرة لاغراض بحثية.




5- وحدة الاستخلاص extraction unit :
يجب ان تجهز بالمعدات اللازمة لاستخلاص كل النواتج الصناعية الواجب استخلاصها بعد عملية التخمير وتعتمد عملية الاستخلاص لاي ناتج ، على الطبيعة الكيمياوية لذلك المركب ويجب ان تلائم الطبيعية المايكروبايولوجية لعملية التخمير .

6- وحدة البيع Sales unit
وهذه مسؤولة عن بيع المنتوج النهائي او الافكار او المعلومات العلمية او العملية سواء التخمير او الكائن المجهري او الاستخلاص او التنقية وغير ذلك