التعقيم Steririlization :
الوسط المعقم:- هو الوسط الخال من الاحياء الحية
لكن عملية التخمير المعقمة Sterile fermentation تعني الاستعمالات الشائعة، أن وسط التخمير به فقط نوع الكائن المجهري لتلك العملية. وعلى الرغم من ان مصطلح التعقيم هو مصطلح مطلق. ألا ان الطرق المستخدمة في قياسه هي نسبية relative . وعليه فان الكائن المجهري قد يتواجد في وسط التخمير لكنه يبقى غير متحرى عنه بسبب كون الوسط الزرعي المستخدم لفحص التعقيم غير قادر على دعم النمو لتلك الانواع من الملوثات.
المخمرات الملوثة تعاني من مشاكل عديدة منها:-
1- المواد الغذائية المتاحة ستحول الى نواتج غير مرغوب بها.
2- الظروف البيئية في المخمر ستغير وبذلك فان العزلة المستخدمة في عملية التخمير ستصبح غير قادرة على الانتاج او ان وسط التخمير اصبح غير قادر على استمرار حفظ السلالة او حفظ الناتج المطلوب.
فمثلاً:- الاحياء الملوثة لوسط التخمير الخاص بالبنسلين والتي لها القدرة على انتاج مواد من لديه ستسبب برفع قيمة الـ PH بدرجة كبيرة مسببة تكسير البنسلين المنتج حديثاً وايضاً منع الفطر penicillium chrysogenam من انتاج كميات اخرى من البنسلين.
3- تنتج الملوثات انزيمات محطمة للمنتوج النهائي مثلاً:- بعض البكتريا تحطم بسرعة البنسلين من خلال انزيم penicillinase .
طرق التعقيم:- الطرق المستخدمة في التعقيم في الصناعة تقع ضمن 6 مجاميع لكل منها استخدام معين وتشمل:-
1- طرق البخار العالي (ضغط البخار العالي) high pressure steam
2- pasteurization and tyndalization
البسترة والتندلة
3- الحرارة الجافة dry heat
4- الكيمياويات chemicals
5- الاشعاع radiation
6- الترشيح filtration
اولاً:- استخدام ضغط البخار العالي:-
معظم التخمرات الصناعية تحتاج الى اوساط في بداياتها. ويمكن الوصول الى هذه الاوساط المعقمة. بضخ بخار الى داخل وسط التخمير وجعل حرارة الوسط تصل الى 120 م2، أو يمكن ان يضخ البخار عبر ملفات حرارية Heating coils موجودة على الجدران الداخلية للتخمر. ويتم تعقيم الدقائق الصلبة للوسط من خلال عملية تحرك مناسبة للوسط خلال دورة التعقيم. ويجب ان يكون كل ما موجود داخل المخمر من حيث الاجراء أو وسط التخمير يجب أن يبقى بدرجة حرارة التعقيم للفترة الزمنية المطلوبة والتي لاتقل عن 15 دقيقة.
والجيوب الباردة Cold packets والتي يمكن ان يتجمع بها الوسط غير المعقم كأنبوب أخذ النماذج او الشقوق او الانحناءات الموجودة في جدار المخمر يجب ان تستبعد من خلال التصميم الصحيح للمخمر. وقياسياً فأن مخمراً سعة 14 الاف غالون من الوسط الزرعي يحتاج الى 4 ساعات لاستكمال دورة تعقيمه عند استخدام بخار له ضغط بقياس 100 باوند /انج2.
في كل هذه المدة في التعقيم فان 90 دقيقة تحتاجها لرفع درجة حرارة الوسط الى 120م° و 30 دقيقة للتعقيم بتلك الدرجة و120 دقيقة أخرى للوصول الى درجة التبريد المعنية قبل عملية التلقيح ويتطلب التعقيم بالبخار مسخن Boiler له القدرة على تجهيز بخار بضغط 100 psig وملفات تسخين Heating coils مقسمة لتعمل بنفس الضغط السابق ومخمر مصمم للعمل تحت ضغط 15 psig . والتصميم يجب ان يسمح للهواء للخروج بسهولة من الادوات لمنع حدوث الجيوب الباردة التي يمكن ان تنشأ وخصوصاً في المخمرات العالية. والضغط الكلي بداخل المخمر هو:- مجموع الضغط الجزئي في البخار والهواء المحجوزان بداخله. ولذا فان أي هواء موجوداً بداخل المخمر سيؤثر ويشارك في الضغط الكلي وسيقلل من ضغط البخار وبالتالي يسبب الفشل في الوصول الى درجة الحرارة المطلوبة في التعقيم.
ان وجود جيوب صغيرة من الهواء قد تكون مطمورة في بعض انابيب التوصيل. قد يكون لها تاثير على درجة حرارة الوسط او المعدات لكنها تسبب زيادة في جفاف البخار في تلك المنطقة وبالتالي فشل عملية التعقيم. وعندما يضخ البخار بشكل مباشر في المخمر البارد لتعقيم وسط التخمير فانه سيبرد البخار ويتكاثف والماء الناتج عنه سيخفف الوسط بنسبة قد تصل الى 20% وبالتالي فان كمية البخار المطلوبة في التعقيم يمكن حسابها من المعادلة التالية:-
10 VT
W=
L
حيث
W: هو الحجم التقريبي للبخار المطلوب
V: حجم الوسط المراد تعقيمه بالغالون
T: الارتفاع الحاصل بدرجة حرارة الوسط (فهرنهايت)
L: الحرارة الكامنة Latertllatent heat of steam (بالسعرة)
اما عند التعقيم بـ Autoclare فعلى العكس مما سبق يؤدي الى تركيز الوسط بمقدار 3-4% وعند وضع الاوعية الحاوية على الاوساط الزرعية بجهاز التعقيم وغلق الباب ، يبدأ البخار بالنزول الى جوف الجهاز ويبدأ بطرد الهواء خلال فتحات بالاعلى والاسفل، تبدأ درجة الحرارة بالارتفاع ، وعندما تصل الى 90-100م° تتوقف عملية طرد الهواء من خلال صمام للتهوية لكن البخار يستمر بالنزول حتى يصل الضغط داخل الجهاز الى 15 باون/انج2 وهنا يبدأ التعقيم الذي يجب ان يستمر بالفترة الزمنية المطلوبة.
تنتقل الحرارة من البخار الى الوسط الزرعي من خلال تكاشف البخار على سطح الوعاء وانتقالها عبر الجدار وفي هذه المرحلة يحصل بعض التخفيف للوسط في الحالات التطبيقية ، فان قياس درجة حرارة البخار والضغط داخل جهاز التعقيم، أمر طبيعي من اجل ضبط ذلك، لضبط الضغط المستخدم والوقت اللازم للتعقيم وعادة ما تنشأ الصعوبات عندما يراد تعقيم كميات كبيرة من السوائل او السوائل التي بها مواد صلبة وهنا تعقيم الامور. ويمكن توضيح ذلك في المثال التالي:
اذا اردنا تعقيم 50 ml في دورق سعة 250ml فاننا نحتاج الى 15 دقيقة للوصول الى حالة التعقيم الكاملة بضغط 15 باوند/انج2 ، لكنها تحتاج الى 2-3 ساعة لتعقيم 3 لتر من الوسط الزرعي الخلوي على مواد صلبة . ومعظم الوقت هذا تحتاجه بسبب كون درجة حرارة الاوساط الزرعية الكبيرة او الحاوية على مواد صلبة تقع خلف او بعد درجة حرارة الجو في جهاز التعقيم.
a: يمثل العلاقة بين الزمن والحرارة داخل جهاز التعقيم
b: تمثل سرعة ارتفاع الحرارة للاوساط الزرعية الصغيرة عندما تعقم تحت نفس الظروف (مثلاً(25-50) مل في فلاسك صغير)
c: تمثل سرعة ارتفاع الحرارة للاوساط الزرعية الكبيرة
d: تمثل سرعة ارتفاع الحرارة للاوساط الزرعية الحاوية على مواد صلبة
ان عملية لتعقيم باستخدام البخار يمكن ان تحدث بطريقتين هماBatchwise in the fermenter وذلك عن طريق : تسخين media بالحقن المباشر بالبخار الى الوعاء ومحتوياته من خلال امرار البخار غير مباشر بأنابيب مطمورة في الوسط او قد تكون بين الجدارين. والبخار يمر بينهما او يكون باستخدام الحرارة الكهربائية وبذلك فان هذه الحالة تتحقق باحد الطرق التالية :-
a- Steam sparking مزود البخار
b- Double wall جدار مزدوج
c- Embedded pipes in the media انابيب مطمورة
d- Electric coil ملف كهربائي
مضار هذه الطريقة :-
ان التعقيم يحتاج الى ساعات للوصول الى درجة حرارة 120 م° وبالتالي يجب اعادة تبريد الوسط بسرعة حفظاً للوقت وهذا بدوره يسبب :
1- اطالة وقت الانتاج .
2- ولحفظ الوسط بدرجة حرارة معينة ينتج عنها مشاكل عديدة منها:-
1- فقدان البروتين من وسط الطبقة الكيمائية.
2- تحطيم عوامل النمو الموجودة في الوسط.
3- حدوث عملية البلمرة واسوداد الوسط.
الطريقة الثانية
التعقيم المستمر Continuous sterilization :- هذه الطريقة تعطي فوائد منها:-
1- الاقتصاد في الوقت
2- الحيز الضيق
3-تحسين نوعية النمو تبعاً لنوعية الوسط
بهذه الطريقة:- الوسط يمر خلال heat exchanger مبادل حراري والتي بها ترتفع درجة الحرارة الى الحرارة المطلوبة في وقت قصير جداً. ثم يحول الى Holding coil ثم اخيراً يبرد بسرعة من خلال دورة معاكسة بالمعادل لمادة مبردة قد يكون هي الوسط.
Heat exchanger
مبادل حراري
|
ثانياً:البسترة والتندلة:- هي طريقة بسيطة لكنها غير فعالة للتعقيم. قد تستخدم احياناً البسترة:- وهي عملية تسخين المحلول بدرجة حرارة 75-65م° لفترة قصيرة من الوقت حيث تقتل الاشكال الخضرية لكن معظم السبورات تبقى غير متأثرة. تستخدم هذه الطريقة بكثرة في تعقيم الحليب لمنع حدوث تغيير في الطعم فيما لو تم تعقيمه بدرجات حرارة عالية.
اما التندلة:- فهي العملية التي تقتل بها الخلايا الخضرية بدرجة حرارة 80-100م° قبل السماح للسبورات المتبقية بالنمو بدرجة حرارة 37م° ، ثم يعاد قتل الخلايا الخضرية الناتجة من السبورات باعادة التسخين من 80-100م° وعادة تعاد هذه الدورة ثلاث مرات وبذلك تعتبر عملية التندلة اكثر فعاليه في البسترة، لكن حتى هذه لاتعطي الدليل الاكيد على التعقيم. وتستعمل عملية التندلة في المناطق التي يصبح بها التعقيم بالبخار غير ممكن، اما بسبب نقص الاجهزة او: ان تكون عملية التعقيم بالبخار تتلف مكونات الوسط فتصبح غير مجدية.
ثالثاً:- الحرارة الجافة dry heat:-
احياناً يكون من الضروري تعقيم الادوات بالحرارة الجافة . ومنذ زمن العالم كوخ 1881م، اوضح ان هذه الطريقة هي نسبياً غير فعالة، حيث تزداد كفاءة التعقيم مع زيادة محتوى الرطوبة، ويعتقد ان السبب هو قدرة بقاء البروتينات وثبوتيتها للحرارة عند الحالة الجافه. وبعض الامور يمكن توضيحها في المثال التالي الخاص بتجلط البومين البيض.
Water content% coagulation Temp(c°)
50 56
18 80-90
6 145
None 160-170
تأثير الحرارة بدرجة حرارة ثابتة على المكروب:
سبورات البكتريا عادة مقاومة للحرارة، وهي التي تسبب مشاكل اثناء عملية التعقيم ، اما الخلايا الخضرية فتكون حساسة بالمعاملة الحرارية . ان تحطيم المكروبات بالحرارة يمكن توضيحه، يأخذ معلق بالسبورات وبدرجة حرارة ثابته وحساب السبورات بفترة زمنية محددة وبالتالي ان سرعة الموت بسبب الحرارة يمكن حسابها من خلال عدد السبورات الحية المتبقية باستمرار الوقت
D =Thermal death time curve
|
N1= No. of cells at T1
N2= No. of cells at T2
بالاستعاضة
Zero time is zero N=O
N= no. of cells at time
5- الاشعاع Radiation
الاشعة الكهرومغناطيسية وخصوصاً في المنطقة فوق البنفسجية 2400 – 2800 A° تكون قاتلة للاحياء المجهرية حيث تسبب تغيرات غير عكسية في DNA الكائنات المجهرية والاشعة فوق البنفسجسة تحد بشكل فعال في البكتريا المرضية في المستشفيات لكن السبورات خصوصاً لبكتريا B. Subtilis عادة تكون مقاومة لهذا النوع من الاشعاع.
الاشعة عالية الطاقة مثل اشعة كاما والتي يكون مصدرها الكوبلت المشع CO60 تستعمل لتعقيم الادوات ذات الاستخدام المفرد disposable عادة التأثير القاتل يتناسب مع جرعة الاشعاع لكن قدرة الامواج على اختراق الهدف تتناسب عكسياً مع كثافة الوسط وعليه فأن قدرة التعقييم تتلاشى عند زيادة العمق.
6- الترشيح Filtration
يستعمل نوعان من الفلترات عند تعقيم الغازات او السوائل ولكل منها مبدأه والعملية تعتمد على مرور الغاز او السائل عبر المرشح الذي به ثقوب اصغر من البكتريا المراد ازالتها. في هذه المرشحات Sitze filter ,Micropore filter paper.
اما الطريقة الثانية في الترشيح فلا تعتمد على الحجم المعين للثقوب بل على الفرص العشوائية لتصـادم المكروبـي ثـم الالتصاق الى ليف صلب Solid filter ومثل هذه الالياف تحتوي على لييفيات مضغوطة مكونة من مثلاً:- glass woll , cotton weel , stag-wool وتستخدم هذه الطريقة اساساً لتعقيم الهواء ويمكن الحصول على تيار هواء معقم من خلال مرور تيار الهواء بسرعة اقل قدم واحد وعموماً فان كل المواد الليفية يمكن ان تفي بالغرض اذا استعملت بهذه الكيفية ويجب التأكد مسبقاً في ازالة الرطوبة وقطيرات الزيت من الهواء لان الالياف ستصبح مشبعة بسرعة وتسمح قطيرات الرطوبة بازالة المايكروبات من الالياف وهناك ثلاث اسباب شائعة لتلوث فلترات الهواء بالسوائل وهي:-
1- التعقيم الغير صحيح لانظمة ضغط الهواء الكلية Compressed air system
2- هبوط الضغط الشديد المترافق مع انخفاض درجة الحرارة في خط تجهيز الهواء
3- التعقيقم الخاطئ او الصيانة غير الكفوءة ضاغطات الهواء air compresser
والمشكلة الاساسية التي تظهر عند تصميم مرشحات الهواء المضغوط تبرز عندما تكون الرطوبة النسبية بالهواء حوالي 50% درجة الحرارة 45م° والضغط 20 باوند / ، هذا يسبب تكاثف الماء داخل المرشح هذه المشكلة هناك طريقان:- الاول/ هو ضخ الهواء بشكل موجات يتم رفع درجة حرارة كل دفعه اعلى من الحد المطلوب. اما الحل الثاني/ فهو تبريد الهواء لتكثيف الرطوبة وتخليصه منها ثم تسخينه ثانية الى الدرجة المطلوبة قبل ضخه. والتعقيم الملائم لتجهيز الهواء المعقم هو كالآتي:-
Design of compresser of air system to supply sterile air
الكيمياويات Chemical
هناك العديد من المواد الكيمياوية وخاصة تلك التي تتفاعل مع البروتينات يمكن استعمالها في التطهير disinfection والتعقيم Steriliztion . وعلى سبيل المثال المركبات الفينولية والهالوجينات وبروكسيد الهيدروجين واوكسيد الاثيلين والفورمالديهايد. وجميع هذه المركبات تكون للانسان في التراكيز العالية.
ومن الجدير بالذكر ان المعقمات الكيمياوية تعتبر غير معول عليها في تعقيم الادوات وكذلك الاوساط العضوية المعقدة. ولتعقيم الجروح تستعمل 10% من الفينول او Carbolic acid وكذلك في تعقيم ادوات التشريح حيث تعمل هذه المركبات على تكوين معقدات مع البروتينات البكتيرية بعدها تعمل على تجلط هذه البروتينات يجب ان تعامل هذه الانواع من المركبات بعناية فائقة لتجنب حدوث حرائق بسببها وخاصة الفينولات.
يستخدم الماء المعقم بالكلورين او مسحوق القاصر في تعقيم الخزانات او انابيب نقل الماء في التخمرات الكحولية. وتعتمد الفعالية القاتلة للكلورين على سرعة وشدة التفاعل حتى في التخافيف العالية.
يستخدم الفورمالديهايد في تعقيم او تعفير الغرف والبنايات ولكن مساوئه تتمثل برائحته القوية المخدشة للاغشية المخاطية وتضعف فعاليته بسبب نفاذية بخاره الضعيفة .
ومن الملاحظ انه بالرغم من حساسة بكتريا Staph albus للفورمالين فانها تحتاج الى التعرض لعدة ساعات لغرض قتلها.
يعتبر مركب اوكسيد الاثيلين مفيد في التطهير CH2 ــ CH2 ولكن مزجه مع الهواء بنسبة 80% سيكون قابل للانفجار. O
ويكون سام حتى بتراكيز لايمكن تحسسها بواسطة الشم .
من المركبات الاخرى المركب - propiolactone (%1 – 0.5) حجم / حجم يكون سام لذلك يعتبر معقم للمعدات وللادوات المستعملة وكذلك سطوح مناضد العمل في المختبر.
2- اختبارات النقاوة Sterility testing
اختبارات النقاوة التي تجرى على كميات قليلة من الوسط الزرعي للمخمر قد توضح ان الكمية الكبيرة من وسط التخمير غير ملوثة. لكنها لايمكن ان تثبت ان الوسط معقم ومع هذا فأن مثل هذه الفحوصات لها اهمية عملية الا انها احادية الجانب فمثلاً التلوث المراد كشفه عند اجراء فحوصات النقاوة يأخذ نموذج حجمه 500 مل من مخمر سعة 20.000L معقم فيفترض ان يحوي المخمر على نوع واحد من الكائنات الحية أي خلية واحدة ضمن 500ml. اما التلوث فان اعداده بالحقيقة اكبر ويستلزم وجود على الاقل 40000 خلية متجانسة التوزيع في عموم وسط التخمير لتأكيد وجود التلوث عند اخذ نموذج بحجم 500ml الا ان خلايا التلوث قد تكون متجمعه في جيوب وغير منتشرة مما يؤثر على كفاءة الفحص ونفس الشيء يمكن تقليل اختبارات النقاوة حسب الطريقة المستخدمة وهذه يجب ان نهيء الظروف الملائمة لنمو الملوثات الموجودة بالمخمر لكي يمكن التحري عنها مثال ذلك اختبارات النقاوة في المخمرات الهوائية يجب ان تصمم للتحري عن البكتريا الهوائية وليس البكتريا اللاهوائية.
والسلالات ذات النمو البطيء في الاحياء المجهرية الصناعية مثل:- الفطريات والاكتيوماميات actinomycetes وخصوصاً عندما تكون الاصابة او التلوث في المراحل الاولية من عملية التخمير تعاني هذه السلالات كثيراً في مشكلة التلوث، والتلوث الاكثر شيوعاً في مخمرات الـ actinoncycetes التي تنتج الستبرمايسين ومخمرات الفطريات التي تنتج البنسلين هي البكتريا المكونة للسبورات شريطة النمو مثل Bacillas subtilis وهذه البكتريا يمكن التحري عنها بتخطيط جزء من وسط التخمير على سطح وسط صلب ملائم.
3- الظروف غير الملوثة Asepsis
المبدأ العام هنا تحويل الظروف البيئة غير الملائمة وتبديلها بشكل كبير منع او تحديد النمو للاحياء الملوثة بدلاً من قتلها ، كما في عملية التعقيم . ودرجة تحويل او تغيير الظروف هذه شائعة في العديد من مجالات حياتنا اليومية ولكنها مفيدة ومهمة في عمليات الصناعة المايكروبايولوجية ومن اهمها :-
- النظافة Cleanliness
المواد الملائمة نمو الاحياء المجهرية غير المرغوب فيها كما في الادوات المستعملة بصناعة منتجات الالبان يمكن استبعادها بالنظافة ، ودائماً المخمرات والانابيب وحلقات الربط والوصل تكون مصنوعة من مواد فولاذية ملساء من الداخل وليس بها ثقوب او شقوق او تجاويف بحيث يمكن تنظيفها بمواد الغسيل بسهولة وتصنع في الغالب من مواد فولاذية غير قابلة للصدأ ، كما ان الصحة العامة للعاملين اجبرتهم في السيطرة على التلوث وخصوصاً عند الصناعات الغذائية ويجب مراعاة النقاط التالية فيما يتعلق بالافراد والعاملين:-
1- تجهيز ملابس تغطية للعمال من اعلى الرأس (غطاء الرأس) الى الاقدام ( احذية خاصة) وبوت .
2- الفحص الصحي الدوري للعمال للتأكد من سلامتهم من الاصابة
3- تجهيز مستلزمات الغسل washing facilitier واجبار العمال على التعود على استخدامها
السيطرة على درجة الحرارة
سرعة نمو الاحياء المجهرية يمكن السيطرة عيها بدرجة كبيرة بالتبريد بحرارة 5م° مثلاً ونمو معظم الانواع يعتبر مهملاً عند درجة الصفر المئوي الا ان بعض انزيماتها يمكن ان تبقى فعالة حتى تصل لدرجة حرارة 80م° . درجات الحرارة الواطئة لوحدها تفشل في قتل العديد من الابواغ والسبورات والتي عادة ما تبقى حية حتى بعد الوصول الى درجة حرارة – 80م° . اما استخدام الثلاجة 5 م° والتجميد – 20م° فتكون خطرة اذا كان على المفروض اعادة رفع درجة الحرارة للمنتوج على فترات خلال فترة الخزن حيث يكن للخلايا الحية ان تتكاثر في المادة بسرعة.
السيطرة على الرطوبة :
يعتبر الماء وبخار الماء ضروري لاستمرار نمو الاحياء المجهرية والسيطرة على الرطوبة لمنع التكاثف ويستخدم تيار هواء ملائم وجاف ولاكن ليس للدرجة التي يسبب فيها جفاف المنتوج ، والحرارة يجب ان تبقى متجانسة التوزيع ويمكن حفظ المنتوج لفترات ويلة اذا جففت سواء بالهواء الحار او التجفيف بالتبريد
المادة المعروضة اعلاه هي مدخل الى المحاضرة المرفوعة بواسطة استاذ(ة) المادة . وقد تبدو لك غير متكاملة . حيث يضع استاذ المادة في بعض الاحيان فقط الجزء الاول من المحاضرة من اجل الاطلاع على ما ستقوم بتحميله لاحقا . في نظام التعليم الالكتروني نوفر هذه الخدمة لكي نبقيك على اطلاع حول محتوى الملف الذي ستقوم بتحميله .