طرق العزل واخذ العينات
هناك طريقتين لعزل البكتيريا
الاولى:الطريقة المباشرة Direct method: وتشمل:-
1- عد الاطباق Plate count وتجرى بعدة طرق مثل الصب pouring او النشر Spreading.
2- العد الاكثر احتمالا Most probable number
3- العد المجهري المباشر Direct microscopic count
· Plate count method : اكثر الطرق شيوعا في تعداد البكتيريا الهوائية والاختيارية اللاهوائية في الاغذية لاعطاء انطباع عن نوعية المحتوى المايكروبي للاغذية ومدى صلاحيته للاستهلاك البشري.
§ Pouring method: تعمل سلسلة من التخافيف العشرية ثم ينقل مقدار مناسب من التخفيف المناسب الى طبق بتري معقم ويصب فوقه الوسط الزرعي المناسب مثل Plate count agar or Nutreint agar.
§ Spreading method: يحضر الوسط الزرعي المناسب مسبقا ويصب في الاطباق ثم ينقل مقدار 0.1 مل من التخفيف الغذائي الملائم وينشر على سطح الوسط بواسطة الناشر Spreader من التخفيف الاعلى الى الاوطئ.
· Most probable number: تخفف عينة الغذاء الى تخافيف عشرية ثم ينقل 10) و1 و 0.1 مل) من التخفيف الملائم الى 9 انابيب حاوية على وسط زرعي ملائم مقسمة الى ثلاث مجاميع وبعد الحضن يلاحظ النمو في كل انبوب من خلال وجود العكورة ثم تستخرج قيمة MPN من الجداول القياسية وتضرب بمعكوس التخفيف لاستخراج العدد الكلي من البكتيريا في 1 مل من عينة الغذاء.
· Direct microscopic count: تعد البكتيريا الحية والميتة وتستعمل خاصة في العينات السائلة. ينقل 0.01 مل من العينة الى وسط الشريحة الزجاجية المحدد عليها 1سم 2 مسبقا وتنشر العينة وتترك لتجف في الهواء ثم يثبت الغشاء بالبخار لمدة 5دقائق وتزال الحبيبات الدهنية بالزايلول ثم الكحول ثم الماء بعدها تصبغ العينة وتفحص بعد ان تجف. ويطبق القانون التالي:
عدد البكتيريا (1 مل) = مجموع البكتيريا في كل الحقول\عدد الحقول x مقلوب التخفيف \ حجم العينة
الثانية: الطرق غير المباشرة Indirect methods: وتشمل
· Spectrophtometer method
· Turbidometeric method
· Dry wight
طرق اخذ العينات Sampling methods:
هناك عدة امور يجب مراعاتها عند اخذ العينة الغذائية منها ان تكون العينة عشوائية وان تمثل العينة الغذاء تمثيلا حقيقيا وتؤخذ في ظروف معقمة وبحجم مناسب وتحفظ في ظروف ملائمة لحين فحصها .
أنواع العينات:
1- العينات السائلة: تؤخذ بصورة عشوائية وترج 25 مرة مع المحلول المخفف. مثالها الحليب والعصائر.
2- العينات الصلبة: تؤخذ بواسطة مشرط او مغرفة او ثاقب حسب نوع الغذاء. فالمساحيق مثلا تؤخذ منها عدة غرامات من أماكن متفرقة وتخلط جيدا اما العينات غير القابلة للخلط فتؤخذ من اماكن مختلفة وتفحص كل منها على حدة مثل اللحوم.
3- العينات السطحية: تؤخذ شرائح سطحية من المادة الغذائية او تنقل الاحياء المجهرية من العينة الى الاوساط الزرعية دون نقل شي من العينة .
طرق اخذ العينات:-
1- الطبعة:تتم بضغط العينة الصلبة مباشرة على الوسط الزرعي .
2- نقل المادة الغذائية : مثل الفاكهه والخضر حيث يؤخذ جزء منها و يضاف الى 10 مل من المحلول المخفف بعد هرسها .
3- الشرائح السطحية: تقطع شرائح سطحية من السطح الخارجي للمادة الغذائية ثم توضع في محلول مخفف مناسب وتمزج بالخلاط للحصول على محلول متجانس.
4- تحضر اسطوانات من وسط الاكار المغذي المعقم في اسطوانات بلاستيكية ويتم ضغط الطرف الاعلى من الاسطوانة على المادة الغذائية ثم يقطع هذا الطرف وينقل الى طبق معقم بحيث يكون السطح الملامس للمادة الغذائية الى الاعلى ثم يحضن في الحاضنة.
5- تضغط الشريحة الزجاجية علة العينة الغذائية الصلبة ثم تصبغ وتفحص .
6- تعمل مسحات على شكل عيدان ذات نهاية قطنية وتكون جافة للاسطح الرطبة وترطب للاسطح الجافة . تضاف المسحة الى محلول تخفيف ويرج لنقل الاحياء المجهرية العالقة اليه.
عزل الأحياء المجهرية من المواد الغذائية
عزل الاحياء المجهرية من اللحوم
يعد اللحم وسط غذائي مثالي للعديد من المايكروبات لارتفاع نسبة الرطوبة aw (0.99) والبروتين فيه واحتوائه على مركبات نتروجينية وكاربوهيدراتية ومعادن واملاح بكميات مناسبة ويحتوي على العديد من الفيتامينات وبنسب مختلفة حسب نوع اللحم مثل thiamine, riboflavin, folic acid, B6, B12,.كما ان ال pH ملائم لنمو الاحياء التي تسبب احداث تغييرات حيوية غير مرغوبة في اللحم. وفي الحالة الطبيعية تحوي اللحوم عددا من الاحياء المجهرية وتكون الفلورا المايكروبية متكونة اساسا من البكتيريا:
Pseudomonas,Lactobacillus,Bacillus,Leuconostoc, Micrococcus.
1- اللحوم الطازجة الحمراء
تخزن الطاقة في عضلة الحيوان على شكل كلايكوجين واثناء الذبح يتحول الى حامض اللاكتيك فينخفض ال pH من 7.5 اثناء الذبح الى (7.5-6) بعد 4-6 ساعات ثم 5.5 بعد 24 ساعة . هذا الانخفاض في pH اللحم يمنع حدوث هجوم مايكروبي يسبب الفساد.هذا العامل يقل في حالة اثارة الحيوان قبل الذبح بسبب استهلاك الكلايكوجين فتقل كمية الحامض المنتج فيبقى اللحم متعادل مما يزيد احتمالية تعرضه للفساد.
· مصادر تلوث اللحوم
1- التربة والماء واهواء وادوات الذبح والتقطيع.
2- ايدي وملابس العاملين في تجهيز اللحوم.
3- النقل والتسويق.
- الاختبارات التي تجري على اللحوم
1- Total Bacterial count
2- Coliform Bacterial count
3- Staphylococcus aureius Bacterial count
4- Salmonilla Bacterial count
5- Molds and yeast count
· أنواع التلف المايكروبي :
(Aرائحة ومواد لزجة off- oder and slime
اول علامات تلف اللحوم هي ظهور رائحة يتبعها تكون مواد لزجة على السطح , المسبب الرئيسي هو Pseudomonas .
Discoloration تغير لون اللحم (B
تظهر بقع ملونة على سطح اللحم نتيجة لنشاط الاحياء المجهرية التالية:
c) التعفن والتتزنخ Putrification & Rancidity
يحدث التعفن نتيجة لنشاط الاحياء المجهرية تحت ظروف لاهوائية وانتاج انزيم Protease محللة البروتين الى NH3 و H2S وغيرها من المركبات العفنة.
أما التزنخ فيحدث نتيجة تحلل دهن اللحم الى Fatty acids و Glycerol فيعطي الرائحة الزنخة وفي كلا الحالتين البكتيريا المسئولة هي Pseudomonas.
D) تحمض اللحم Meat souring
يحدث عند خزن اللحم في درجة حرارة الغرفة اذ تنشط البكتيريا وسطية الحرارة (Mesophiles) مثل بكتيريا القولون (Coliform) و Lactobacillus هذه البكتيريا تؤكسد المواد السكرية في اللحم الى احماض عضوية .
2- اللحم المفروم:
تحتوي على اعداد كبيرة من الاحياء المجهرية نتيجة تعرض مساحة سطحية اكبر منه الى التلوث حيث تسهم الات فرم اللحم في التلوث إضافة الى خلط الأجزاء الملوثة مع غير الملوثة كذلك فان اضافة التوابل والخضروات الملوثة يضيف أعداد اخرى من الاحياء المجهرية مثل Lactobcillus, Micrococcus, Coliforms, Streptococcus, Yeast.
4- لحم السمك
تعتبر الاسماك اسرع تلفا من اللحوم الحمراء وذلك بسبب:
1) ارتفاع نسبة الرطوبة 2) ارتفاع pH
3) ليونة الانسجة وتفككها 4) دهن السمك اسرع تاكسدا من دهن اللحم الاحمر
5) احتوا الجلد و الحراشف والخياشيم والاحشاء على اعداد كبيرة من الاحياء المجهرية التي تفسد السمك بعد موته بفترة وجيزة.
الفلورا الطبيعية هي نفس الفلورا للمياه المتواجدة فيها , ففي البحار والمحيطات
توجد : Pseudomonas, Achromobacter, Vibrio, Flavobacterium
اما الانهار فتحوي اضافة الى ما سبق: Clostridium, E.coli, Lactobacillus, Bacillus
بسبب وجود المواد العضوية وانخفاض الملوحة.وفي المياه الملوثة توجد انواع من Clostridium و Vibrio المسببة للتسمم الغذائي , ولغرض الحفاض على الاسماك من التلف يجب تبريدها واضافة الملح او الاحماض لخفض ال pH .
5- لحوم الدواجن
ان البيئة التي تعيش فيها الدواجن مليئة بالاحياء المجهرية المتنوعة وعليه فان الفلورا الطبيعية متنوعة ايضا مثل اجناس من :Staphyllococcus, Streptococcus, E.coli, Pseudomonas, Clostredium, Lactobacillus, Salmonilla .
واخطر هذه الانواع هي Salmonilla المسببة للتسممات الغذائية ومصدرها الحقل وما يحويه من مياه وعلف وفضلات .
المواد وطريقة العمل:
1- تحضر سلسلة تخافيف لعينات اللحم الاحمر والمفروم بأخذ شرائح رقيقة من اللحم باستخدام ملقط معقم ويوزن 10 غم من عدة اماكن وتمزج في الخلاط مع 99 مل من ماء الببتون الى ان يتجانس المحلول وتعمل التخافيف 10-3 _ 10-6 .
2- يحضر محلول متجانس من جلد السمكة وامعائها واحشائها بنفس الطريقة.
3- يحضر محلول متجانس من جلد الدجاج وامعائه واحشائه بنفس الطريقة.
الاختبارات
1- التعداد الحي العام للبكتيريا Total viable count
ينقل 0.1 مل من التخفيف الاخير الى الطبق ويصب فوقه الوسط الزرعي المناسب ويحضن وتعد المستعمرات .
2- تعداد بكتيريا القولون
ينقل 0.1 مل من التخفيف الاخير الى الطبق ويصب فوقه الوسط الزرعي MacConky agar ويحضن لمدة 24 ساعة وتعد المستعمرات .
3- التحري عن بكتيريا Salmonilla
يضاف 1 غم من عينة الدواجن الى 9 مل من وسط Selenite broth او Tetrathionate broth (اوساط اغنائية تحوي اليود كمثبط للاحياء الاخرى) تحضن في 37 م لمدة 72 ساعة ثم يخطط على وسط Brillient green agar او وسط Bismoth sulphate agar وتحضن بدرجة 37 م لمدة 24-48 ساعة.
تلاحظ مستعمرات السالمونيلا على وسط Brillient وردية شفافة محاطة بهالة حمراء براقة . اما على وسط Bismoth فمركزها اسود وحافاتها شفافة.
4- تعداد بكتيريا Staphylococcus
يستخدم وسط Staph 110 (Nutrient agar+7.5 NaCl) , ويمكن استخدام وسط المانيتول في حالة عدم توفر الاول.
5- تعداد بكتيريا Lactobacillus : بأستخدام وسط Rogosa .
6- التعداد الكلي المباشر بطريقة Bread
يؤخذ سلايد ويرسم عليه مربع طول ضلعه 1 سم ويوضع عليه مقدار loop full من التخفيف الاول ويثبت ويصبغ ب Crystal violate ويغسل ثم يفحص وتعد الخلايا في 10 مجالات fields وطبق القانون التالي :
عدد الخلايا /مل = (عدد الخلايا في 10 مجالاتx100x5000xمعكوس التخفيف)/10
حيث:
( 100 تمثل حجم Loopfull 0.01 مل),(5000 رقم قياسي ثابت يمثل عدد الحقول في مربع طول ضلعه 1 سم)
Results
|
Microscopic feature
|
cfu
|
Test
|
|
No.
|
+/-
|
|
|
|
|
Total viable count
|
|
|
|
|
Coliform bacteria count
|
|
|
|
|
Staph. aureius B.C
|
|
|
|
|
Salmonilla B.C
|
|
|
|
|
Molds and yeast count
|
س1/ ما الفرق بين الفلورا المايكروبية الموجودة على اللحم و تلك الملوثة له ؟
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.
س2/ ما هي خطورة وجود بكتيريا staph. aureus و salmonella في اللحم ؟
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
س3/ هل تتوقعين ظهور جميع الانواع البكتيرية المذكورة في المختبر على احد الاوساط المستعملة في التجربة؟ لماذا؟
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
س4/ لماذا توجد بكتيريا Flavobacterium و Achromobacter في لحم السمك ولاتوجد في اللحم الاحمر؟
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
المادة المعروضة اعلاه هي مدخل الى المحاضرة المرفوعة بواسطة استاذ(ة) المادة . وقد تبدو لك غير متكاملة . حيث يضع استاذ المادة في بعض الاحيان فقط الجزء الاول من المحاضرة من اجل الاطلاع على ما ستقوم بتحميله لاحقا . في نظام التعليم الالكتروني نوفر هذه الخدمة لكي نبقيك على اطلاع حول محتوى الملف الذي ستقوم بتحميله .